分化无核细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种分化无核细胞及其制备方法。所述方法包括：在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，其中所述试剂为IL‑3和EPO；其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞。所述红细胞可以治疗选自由以下组成的群组的病症：表征为成熟红细胞的缺陷的病症、表征为失血的病症、贫血、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少和血友病。

【技术实现步骤摘要】
分化无核细胞及其制备方法本申请是申请日为2009年7月21日、申请号为200980126312.4、专利技术名称为“分化无核细胞及其制备方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请案交叉参考本申请案主张2008年7月21日申请的标题为分化细胞及其制备方法(DifferentiatedCellsandProcessesforPreparingtheSame)的美国临时申请案第6I/082,410号的优先权，其全部内容以引用方式并入本文中。
本申请涉及分化无核细胞及其制备方法。
技术介绍
无核细胞包括(但不限于)红细胞及凝血细胞。红细胞及凝血细胞来源于造血干细胞分化。
技术实现思路
在某些实施例中，本专利技术揭示制备多种无核细胞的方法，其包含：在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞：(a)使用第一载体转染多种干细胞，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二逆转录病毒载体转染所述干细胞，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的活性。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EPO或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP，且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。在某些实施例中，本专利技术揭示产生多种无核细胞的方法，其包含：在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养条件永生化干细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化干细胞：(a)使多种干细胞与外源合成的第一肽接触，所述第一肽包含移位至细胞核的MYC分子；(b)使所述干细胞与外源合成的第二肽接触，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其组合；及(c)将所述干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前使所述第一肽与所述条件永生化干细胞不接触。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在某些实施例中，本专利技术揭示制备多种无核细胞的方法，其包含：(a)使用第一载体转染多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第一载体包含编码MYC分子的核酸序列；(b)使用第二γ逆转录病毒载体转染所述多种干细胞(例如，造血干细胞)，所述第二载体包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；(c)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(d)抑制所述Myc分子的活性；及(c)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，引导朝向无核细胞分化的细胞因子是IL-3、EPO或其组合。在一些实施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其组合。在一些实施例中，第一载体进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，所述方法进一步包含诱导Myc分子移位至细胞核。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是鼠科动物干细胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP或其衍生物。在一些实施例中，第一载体、第二载体、或第一载体与第二载体二者是MSCV-(IRES)-GFP，且进一步包含土拨鼠乙型肝炎病毒RNA调控元件(WRE)。在某些实施例中，本专利技术揭示产生多种无核细胞(例如，造血干细胞)的方法，其包含：(a)使多种干细胞(例如，造血干细胞)与以下物质接触：(i)外源合成的第一肽，其包含移位至细胞核的MYC分子；及(ii)外源合成的第二肽，其包含Bcl-2、BCL-X或其组合；(b)将所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；(c)移除第一肽；及(d)在至少一种引导朝向无核细胞分化的细胞因子存在下培养所述条件永生化干细胞(例如，造血干细胞)。在一些实施例中，第一肽进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。在一些实施例中，第一肽、第二肽、或第一肽与第二肽二者包含转运蛋白序列。在一些实施例中，第一蛋白质、第二蛋白质、或第一蛋白质与第二蛋白质二者包含TAT序列。在一些实施例中，所述方法进一步包含使所述多种干细胞(例如，造血干细胞)与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-OHT)或二者接触。在某些实施例中，本专利技术揭示根据本文所揭示方法制备的凝血细胞。在某些实施例中，本专利技术揭示根据本文所揭示方法制备的红细胞。在某些实施例中，本专利技术揭示治疗特征在于缺乏无核细胞的病症的方法，其包含：投予根据本文所揭示方法制备的无核细胞。在一些实施例中，所述病症是贫血(例如，再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球形细胞增多症、溶血性贫血)、高歇氏病(Gaucher′sdisease)、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少、血友病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin′slymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′slymphoma)、滤泡样淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或其组合。在某些情形下，特征在于缺乏无核细胞的病症是由化学疗法引起(部分或完全)。在一些实施例中，通过本专利技术所揭示方法产生的无核细胞与化学疗法共投予。附图说明本专利技术的新颖特征详细阐述于随附权利要求书中。参考阐述利用本专利技术原理的例示性实施例的下文详细说明和附图将会更好地了解本专利技术的特征及优点，在附图中：图1显示产生ctlt-造血干细胞系的途径。图1A显示用于使用Myc-ER及Bcl-2转导原代鼠科动物HSC细胞的逆转录病毒构建体的图示。图1B显示自5-氟尿嘧啶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备成熟红细胞的方法，其包含：在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，其中所述试剂为IL‑3和EPO；其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化造血干细胞：a.使用第一核酸转导多个造血干细胞，所述第一核酸包含编码MYC分子的核酸序列；b.使用第二核酸转导所述造血干细胞，所述第二核酸包含编码Bcl‑2、Bcl‑X或其组合的核酸序列；及c.将所述造血干细胞与IL‑3、IL‑6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的一种或多种活性，或已抑制Myc分子的存在。

【技术特征摘要】
2008.07.21 US 61/082,4101.一种制备成熟红细胞的方法，其包含：在诱导分化成红细胞的试剂存在下培养条件永生化造血干细胞，其中所述试剂为IL-3和EPO；其中所述试剂将条件永生化造血干细胞诱导分化为成熟红细胞；其中通过以下来产生所述条件永生化造血干细胞：a.使用第一核酸转导多个造血干细胞，所述第一核酸包含编码MYC分子的核酸序列；b.使用第二核酸转导所述造血干细胞，所述第二核酸包含编码Bcl-2、Bcl-X或其组合的核酸序列；及c.将所述造血干细胞与IL-3、IL-6、干细胞因子、血小板生成素、Flt3配体或其组合一起培养；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的一种或多种活性，或已抑制Myc分子的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸进一步包含人类雌激素受体的激素结合结构域。3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含诱导所述Myc分子移位至细胞核。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其进一步包含使所述造血干细胞与雌二醇(E2)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)(4-OHT)或二者接触。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述造血干细胞进一步包含编码另外的治疗性多肽的核酸序列，其中所述成熟红细胞包括所述另外的治疗性多肽。6.一种产生成熟...

【专利技术属性】
技术研发人员：优素福·里菲利，布赖恩·柯蒂斯·特纳，
申请(专利权)人：泰加生物工艺学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US