PDGFRA基因突变检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种PDGFRA基因突变的检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液A、PCR检测液B和SYBR GreenI混合液；PCR检测液A包括用于检测PDGFRA基因第12外显子V516D位点的上下游引物A和肽核酸A，PCR检测液B包括用于检测PDGFRA基因第18外显子D842V位点的上下游引物B和肽核酸B。本发明专利技术的PDGFRA基因突变检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PDGFRA基因突变检测。

PDGFRA gene mutation detection system and its kit

The present invention relates to a PDGFRA gene mutation detection system and kit kit, including PCR A, PCR detection of liquid liquid B and SYBR detection GreenI mixture; PCR detection of liquid A includes means for detecting PDGFRA gene exon twelfth V516D loci primers A and peptide nucleic acid A, including B PCR detection solution for the detection of PDGFRA gene exon eighteenth D842V loci primers B and B peptide nucleic acid. The PDGFRA gene mutation detection system and its kit has high sensitivity and specificity, and less sample demand. It can detect PDGFRA gene mutation quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
PDGFRA基因突变检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测PDGFRA基因突变的方法和检测产品，属于生物

技术介绍
研究已经发现在多种人类癌症(胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、恶性外周神经鞘等肿瘤)中存在PDGFRA的扩增、缺失、及体细胞突变，研究发现，PDGFRA的突变不仅与人类恶性肿瘤的发生发展有关，而且与肿瘤的分期、分级及预后也有密切关系。因此，检测肿瘤患者不同阶段中PDGFRA突变，对患者判断预后有着重要的意义探索患者PDGFRA耐药机制及预测预后成为一条可行的途径，现在已经明确肿瘤细胞会释放DNA进入循环系统，使得通过“液态活检”的方式，能够对早期及晚期肿瘤患者特定的核酸序列进行分析，是一种非侵入性的检测肿瘤基因及临床治疗效果的一种方法，而且患者对非侵入性样本采集方式的接受度更高。但是由于大多数人血清/血浆中cfDNA含量低，在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01％，且cfDNA片段相对小等原因，目前对肿瘤相关基因的临床检测主要是测序法和ARMS法，并不适用。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。目前进行PDGFRA基因突变检测的方法主要有芯片技术、探针引物技术、酶切、焦磷酸测序技术和HRM分析技术等，价格贵、繁琐或准确性不高。因此，开发一种检测PDGFRA基因突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的PDGFRA基因突变检测是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PDGFRA基因突变检测的PDGFRA基因突变检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PDGFRA基因突变检测体系，包括用于检测PDGFRA基因第12外显子V516D位点的上下游引物A，用于PDGFRA基因检测第18外显子D842V位点的上下游引物B，荧光染料SYBRGreenI，以及肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与野生型PDGFRA基因第12外显子V516D位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列与野生型PDGFRA基因第18外显子D842V位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。上述上下游引物A、B进行了LNA修饰。上述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。上述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L。上述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的检测体系的PDGFRA基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种PDGFRA基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B和SYBRGreenI混合液；所述PCR检测液A包括用于检测PDGFRA基因第12外显子V516D位点的上下游引物A和肽核酸A，所述PCR检测液B包括用于检测PDGFRA基因第18外显子D842V位点的上下游引物B和肽核酸B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述肽核酸包括核苷酸序列与野生型PDGFRA基因第12外显子V516D位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列与野生型PDGFRA基因第18外显子D842V位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。上述上下游引物A、B进行了LNA修饰；所述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L，所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。上述PDGFRA基因突变检测试剂盒还包括阳性对照P1、阳性对照P2和阴性对照；所述阳性对照液P1是浓度为100ng/μL的包含PDGFRA基因第12外显子V516D位点和第18外显子D842V位点的野生型质粒溶液；所述阳性对照液P2是浓度为100ng/μL的包含PDGFRA基因第12外显子V516D位点和第18外显子D842V位点的突变型质粒溶液；所述阴性对照液是不含PDGFRA基因的基因组DNA溶液。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需通过熔解曲线分析，即可将PDGFRA基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。(2)本专利技术的PDGFRA基因突变检测方法及其试剂盒，可同时检测第12、18外显子任意一种突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本专利技术容易地检测出非常低浓度样本的PDGFRA基因突变状态，克服了TaqMan探针法需要使用多条特异性探针分别进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。(3)本专利技术选择SYBRGreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。附图说明图1采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的V516D野生型位点特异性产物峰Tm值。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P1的D842V野生型位点特异性产物峰Tm值。图3是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的V516D突变型位点特异性产物峰Tm值。图4是采用实施例的试剂盒检测阳性对照P2的D842V突变型位点特异性产物峰Tm值。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。一、试剂盒的组成。本实施例的PDGFRA基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液A、PCR检测液B、SYBRGreenI混合液、阴性对照、阳性对照P1和阳性对照P2。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表成分分装组成PCR检测液A1管V516D位点引物、肽核酸PCR检测液B1管D842V位点引物、肽核酸SYBRGreenI混合液1管——阳性对照P11管含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测PDGFRA基因第12外显子V516D位点的上下游引物A，用于检测PDGFRA基因第18外显子D842V位点的上下游引物B，荧光染料SYBR Green

【技术特征摘要】
1.一种PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测PDGFRA基因第12外显子V516D位点的上下游引物A，用于检测PDGFRA基因第18外显子D842V位点的上下游引物B，荧光染料SYBRGreen，以及肽核酸；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述肽核酸包括核苷酸序列与PDGFRA野生型基因第12外显子V516D位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列与PDGFRA野生型基因第18外显子D842V位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸B。2.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A、B进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A、B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L。4.根据权利要求3所述的PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物A在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L，所述上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.2μM/L。5.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1～1.5μM/L。6.根据权利要求5所述的PDGFRA基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸A、B在反应体系中的最终浓度均为1.25μM/L。7.一种采用如权利要求1所述的检测体系的PDGFRA基因突变检测产品。8.一种P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31