活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用制造技术

本发明专利技术涉及属于生物技术领域，特别涉及活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用。本发明专利技术的目的是获得一种能够诱导HSP70转录表达的蛋白序列即NS31基因的编码序列的应用，使用NS31重组质粒pEGFP‑N1‑NS31在真核细胞中能够诱导热休克蛋白HSP70转录活化。

The application of the encoding sequence of the NS31 gene that activates HSP70

The invention relates to the application of the coding sequence of the NS31 gene, which belongs to the field of biotechnology, especially the activation of HSP70. The purpose of the invention is obtained using the encoding sequence of a protein can induce HSP70 transcription and expression of NS31 gene sequences, using NS31 recombinant plasmid pEGFP N1 NS31 in eukaryotic cells can be induced by heat shock protein HSP70 activator.

【技术实现步骤摘要】
活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用
本专利技术涉及属于生物
，特别涉及活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用。
技术介绍
热休克效应是生物体在受热条件下保守的应激反应之一，在哺乳动物细胞中，热休克诱导细胞膜，细胞骨架和细胞器结构与功能的改变，影响细胞死亡，细胞周期，基因的转录翻译以及DNA的复制和修复等生命过程。热休克蛋白(Heatshockproteins，HSPs)在受热，生理变化或小分子化合物刺激下被诱导转录表达；热休克蛋白HSP70家族在真核生物中高度保守，能够促进蛋白折叠，降解和跨膜转运，以及蛋白与蛋白的相互作用等。HSP70的抑制剂和活化剂可以应用于热休克蛋白的基础研究领域，也可应用于新药开发的领域；许多小分子化合物能够抑制或活化HSP70的转录表达，如Apoptozole抑制热激蛋白HSP70和Hsc70转录表达；TRC051384能通过HSF1的激活诱导HSP70表达等。中国专利技术专利申请公布号：CN102816792A(一种调控热休克蛋白70表达、数量及活性的方法及其应用)，以RNA干扰技术，下调肿瘤细胞或组织中HSP70的表达，联合应用抗肿瘤药物TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡；中国专利技术专利申请公布号：CN105439972A(热休克蛋白抑制剂及其制备方法和应用)，提供一种新的热休克蛋白抑制剂，该类化合物能够抑制HSP90的活性，进而可以用于制备抗肿瘤的药物中；目前，国内没有HSP70的活化剂的研究报道和专利公开。草鱼呼肠孤病毒粒子直径约70nm，正二十面体；具有双层衣壳，无脂质囊膜包被；主要通过受体吸附，胞吞作用(Endocytosis)侵染宿主细胞，在细胞质中复制装配，其基因组是11个分节段的dsRNA，基因组编码12个蛋白，其中NS31蛋白由Seg-7基因编码，非结构蛋白NS31是个潜在的转录因子，在细胞质和核中均有分布；本专利技术中说明NS31蛋白能够促进HSP70转录，具有活化特性。现有技术应用中，HSP70的活化剂大多是小分子化合物类，这些小分子化合物本身存在如下问题：1)一些化合物对细胞和动物具有毒性；2)特异性较差，在活化HSP70的同时可能还影响其它热休克蛋白的转录表达，如HSC70，HSP90和其它小分子类热休克蛋白；3)制备工艺要复杂，获得高纯度的化合物(99.9％)成本较高。细胞在热刺激条件下，启动一系列热应激反应，诱导大部分热休克蛋白的活化转录包括HSP70，这一方法是最典型的热休克效应的诱导方法，但其诱导HSP70活化的同时还诱导其它一系列蛋白的转录表达。
技术实现思路
本专利技术公开活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，本专利技术的目的是获得一种能够诱导HSP70转录表达的蛋白序列即NS31基因的编码序列的应用，使用NS31重组质粒pEGFP-N1-NS31在真核细胞中能够诱导热休克蛋白HSP70转录活化。为解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，(1)将载体pEGFP-N1和NS31基因的编码序列分别利用XhoI/PstI限制内切酶进行双酶切，37℃，20-30min，进行DNA纯化，T4连接酶16℃连接18-20h，与绿色荧光蛋白GFP编码基因形成一个完整的阅读框获得pEGFP-N1-NS31质粒；(2)用步骤(1)中获得pEGFP-N1-NS31质粒转染真核细胞中，够诱导热休克蛋白HSP70转录活化，同时不会对HSC70和HSP90转录水平产生影响。所述步骤(1)中NS31基因的编码序列通过设计克隆引物进行RT-PCR从GCRV-JX01病毒感染的草鱼肾脏细胞中扩增出。所述克隆引物为：F:CCGCTCGAGATGAACGCCGACCGCACC；R:AAAACTGCAGCCAGCAACCATTGTCCATTAAC。下划线分别为酶切位点XhoI/PstI及其保护碱基。所述PCR反应体系为：50μl体系中：ExTaqBuffer5μl，dNTP4μl，10mmol/L克隆引物正引物F1-2μl，10mmol/L克隆引物正引物R1-2μl,ExTaq酶0.1-0.3μl，ddH2O剩余；所述PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1-1.5min，30-35个循环；72℃补充延伸5min。所述步骤(1)中的NS31基因的编码序列在Genbank的登录号为MG189638。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术获得一种能够诱导HSP70转录表达的蛋白序列即NS31基因的编码序列。2、本专利技术构建一个能够在真核细胞中表达NS31蛋白的重组质粒，即质粒pEGFP-N1-NS31。3、本专利技术使用NS31重组质粒pEGFP-N1-NS31在真核细胞中能够诱导热休克蛋白HSP70转录活化，同时不会对HSC70和HSP90转录水平产生影响。附图说明图1为NS31蛋白在CIK细胞中特异性诱导热休克蛋白HSP70转录表达；(A)HSP70mRNA相对表达量，(B)HSC70mRNA相对表达量，(C)HSP90mRNA相对表达量。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明：实施例11.NS31基因序列的克隆与pEGFP-N1-NS31质粒载体的构建分离的GCRV-JX01病毒株保藏于上海海洋大学国家水生动物病原库，草鱼肾脏细胞CIK购自武汉培养物保藏中心，真核表达载体pEGFP-N1购自Takara公司。从感染GCRV-JX01的草鱼肾脏细胞中提取总RNA逆转成cDNA。总RNA提取：感染GCRV-JX01的细胞用1mlTRIzol重悬；加入200μl氯仿/；然后剧烈振动15s，室温下孵育2.5分钟。4℃，12000×g离心15分钟；离心后，取上层的水相600μl；加入500ul异丙醇混匀。室温静置10分钟，4℃，12,000×g离心15分钟；弃上清，75％的乙醇洗涤；4℃，7,500×g离心5分钟；30μlRNaseFreedH2O重悬RNA.逆转录体系：RTaseMix(20U/μl)10μl，提取的RNA1μl，RNaseFreedH2O补足20μl。根据NS31基因序列设计克隆引物F:CCGCTCGAGATGAACGCCGACCGCACCR:AAAACTGCAGCCAGCAACCATTGTCCATTAAC，PCR扩增目的片段，PCR反应体系及条件：总体系50μl，ExTaqBuffer5μl,dNTP4μl,正反引物F/R各1ul(10mM)，ExTaq酶0.25μl，用ddH2O补齐50μl；反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃补充延伸5min。将载体pEGFP-N1和目的片段分别利用XhoI/PstI限制内切酶进行双酶切，37℃，30min；DNA纯化后，利用T4连接酶，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证pEGFP-N1-NS31质粒构建成功。2.pEGFP-N1质粒转染草鱼肾脏细胞CIK将生长状态良好的草鱼肾脏细胞CIK传代至6孔细胞培养板中，28℃培养12h，待细胞密度至80％时转染。利用脂质体LipofectamineTM3000本文档来自技高网...

【技术保护点】
活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，其特征在于：(1)将载体pEGFP‑N1和NS31基因的编码序列分别利用Xho I/PstI限制内切酶进行双酶切，37℃，20‑30min，进行DNA纯化，T4连接酶16℃连接18‑20h，获得pEGFP‑N1‑NS31质粒；(2)用步骤(1)中获得pEGFP‑N1‑NS31质粒转染真核细胞中，够诱导热休克蛋白HSP70转录活化，同时不会对HSC70和HSP90转录水平产生影响。

【技术特征摘要】
1.活化转录HSP70的NS31基因的编码序列的应用，其特征在于：(1)将载体pEGFP-N1和NS31基因的编码序列分别利用XhoI/PstI限制内切酶进行双酶切，37℃，20-30min，进行DNA纯化，T4连接酶16℃连接18-20h，获得pEGFP-N1-NS31质粒；(2)用步骤(1)中获得pEGFP-N1-NS31质粒转染真核细胞中，够诱导热休克蛋白HSP70转录活化，同时不会对HSC70和HSP90转录水平产生影响。2.根据权利要求1所述的应用：其特征在于：所述步骤(1)中NS31基因的编码序列通过设计克隆引物进行RT-PCR从GCRV-JX01病毒感染的草鱼肾脏细胞中扩增出。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述克隆引物为：F:C...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕利群，喻飞，王浩，李婉娟，王龙龙，孙皓，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31