一种抗菌肽KK26及其应用制造技术

本方案公开了生物技术领域的一种抗菌肽KK26，其氨基酸序列为：Lys‑Lys‑Lys‑Ile‑Ala‑Arg‑Tyr‑Leu‑Asn‑Tyr‑Gly‑Ala‑Ile‑Val‑Thr‑Arg‑Ile‑Val‑Leu‑Pro‑Trp‑Val‑Arg‑Lys‑Val‑Arg。该抗菌肽为直链多肽，含有26个氨基酸残基，分子量大小为3141.4Da，等电点12.13。抗菌肽KK26对红细胞的溶血性低，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和部分真菌都具有高效的抗菌作用。所以，菌肽KK26在制备抗感染细菌或/和真菌疾病药物以及抗生素替代药物上能够得到较佳的应用。同时，本发明专利技术产品抗菌肽KK26可应用于食品、保健品、化妆品和饲料等的防腐。

An antibacterial peptide KK26 and its application

This scheme discloses an antimicrobial peptide KK26 in the biotechnology field, its amino acid sequence is: Lys Lys Lys Ile Ala Arg Tyr Leu Asn Tyr Gly Ala Ile Val Thr Arg Ile Val Leu Pro Trp Val Arg Lys Val Arg. The antibacterial peptide is a direct chain polypeptide containing 26 amino acid residues, with a molecular weight of 3141.4Da and an isoelectric point of 12.13. The antibacterial peptide KK26 has low hemolysis and broad spectrum of red blood cells. It has an effective antibacterial effect on Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and some fungi. Therefore, the bacterial peptide KK26 can be better used in the preparation of anti - infective bacteria or / and fungal disease drugs, as well as antibiotic substitution drugs. At the same time, the antibacterial peptide KK26 of the invention can be applied to the anticorrosion of food, health products, cosmetics and feed.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽KK26及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种抗菌肽KK26及其应用。
技术介绍
抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码，核糖体合成的一类小分子活性多肽，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。AMPs作为一种生物活性小分子，普遍具有抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性。另外，AMPs还可以作为药物传递载体、抗肿瘤剂、免疫调节剂以及信号分子等。抗生素作为一类重要的临床用药，自被应用以来已拯救了无数人的生命。但近年来，由于药物滥用、药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，越来越多的国家开始寻求抗生素替代品，而抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已成为最具潜力的抗生素替代品之一。另外，抗菌肽在新型食品、药品、护肤品以及化妆品防腐剂和饲料添加剂等方面的应用也越来越广泛，具有良好的发展前景。抗菌肽的相关研究最早可以追溯到1975年，当时瑞典科学家G.Bomam等在惜古比天才蛹中注入大肠杆菌，之后在其血液淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质，即抗菌肽Ceropins。经过40几年的研究，目前已从动物、植物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽。虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足。相当一部分天然的抗菌肽抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高，或者导致真核细胞发生溶血等；另外，部分抗菌肽对耐药菌的抑制效果差，不能满足实际应用的要求；而通过对天然抗菌肽进行改造或全新合成得到的人工抗菌肽可以在很大程度上改善以上某些甚至所有缺点，以适应不同应用需求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种对耐药菌的抑制作用强，能够有效抑制金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌滋生的抗菌肽KK26，以及抗菌肽KK26的应用。本方案中的一种抗菌肽KK26，所述抗菌肽KK26的氨基酸序列为：Lys-Lys-Lys-Ile-Ala-Arg-Tyr-Leu-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Val-Thr-Arg-Ile-Val-Leu-Pro-Trp-Val-Arg-Lys-Val-Arg。本专利技术的抗菌肽KK26中，K和K是短肽前两个氨基酸的缩写，26是氨基酸数，为本领域的常规命名方法。本专利技术的抗菌肽不但对大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，同时对白色念珠菌也有良好的抑制效果。而且具有很低的溶血活性，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。进一步，所述抗菌肽KK26为α螺旋直链多肽，含有26个氨基酸残基，分子量大小为3141.4Da，等电点为12.13。进一步，所述抗菌肽KK26在制备治疗细菌或者真菌感染的广谱抗菌药物中的应用。因为本专利技术提供的抗菌肽KK26具有较强的抑菌效果，而且对常见的大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，所以其可以用于制备抗菌剂，并在治疗细菌或者真菌感染方面具有良好效果。进一步，所述广谱抗菌药物指抗感染革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物。本专利技术提供的抗菌肽KK26对大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，所以用其制备抗感染革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物对治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌疾病的感染具有良好效果。进一步，所述抗菌肽KK26在制备抗生素替代药物中的应用。抗菌肽KK26对水产养殖致病菌副溶血弧菌与哈氏弧菌菌株等都有极好的抑菌效果，且抑菌效果受盐浓度影响小，在水产养殖业中具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。进一步，所述抗菌肽KK26在制备食品、保健品或化妆品防腐剂中的应用。由于抗菌肽KK26对多种细菌和真菌均具有较好的抑制作用，并且对红细胞的参透脆性影响很小，对人体副作用极小，用于制备食品、保健品或化妆品防腐剂中，能有效的抑制病菌的生长，同时不会对人体产生不良反应。进一步，所述抗菌肽KK26在制备饲料添加剂中的应用。因为本专利技术提供的抗菌肽KK26对副溶血弧菌和哈氏弧菌也具有较强的抑制作用，而这两种病菌常存在与水产中，所以可以将抗菌肽KK26添加到水产饲料中，通过喂食的过程对副溶血弧菌和哈氏弧菌的滋生繁殖进行有效的抑制，防止水产品感染，甚至患病死亡。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细的说明：实施例：本专利技术抗菌肽KK26产品为SEQIDNO.1中的氨基酸序列，其序列为：Lys-Lys-Lys-Ile-Ala-Arg-Tyr-Leu-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Val-Thr-Arg-Ile-Val-Leu-Pro-Trp-Val-Arg-Lys-Val-Arg。序列特征：长度为26，类型为氨基酸序列，链型为直链，人工合成。本实施例抗菌肽KK26产品是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相合成，最终得到的抗菌肽KK26经高效液相色谱分析，其纯度≥98％；具体制备方法包括以下步骤：1)树脂溶涨：称取取代度为0.4mmol/g的0.6g2-ChlorotritylChlorideResin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Arg-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入10mlDMF溶解，振荡1h；用DMF和DCM交替清洗6遍；3)脱保护：加15ml浓度为20％的哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加15ml的20％的哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min；4)检测：抽掉哌啶溶液，取10～15粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、嘧啶和苯酚溶液各50μL，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；5)洗：按DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次依次清洗；6)缩合：保护氨基酸Fmoc-L-Val-OH三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量，反应30min；7)洗：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；8)重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；9)最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min；10)从树脂上切割多肽：配制切割液15ml，其中TFA94.5％；水2.5％；EDT2.5％；TIS0.5％，将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，在30℃恒温震荡120min；11)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干,即得所述抗菌肽；12)用HPLC纯化多肽：(1)取粗品肽200mg放入器皿中，用2～5ml50％的乙腈水溶液溶清，可以稍微超声2min；(2)用0.45μm滤膜过滤溶解液；(3)分析：取3μl用分析级HPLC分析粗品；流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽KK26，其特征在于：所述抗菌肽KK26的氨基酸序列为：Lys‑Lys‑Lys‑Ile‑Ala‑Arg‑Tyr‑Leu‑Asn‑Tyr‑Gly‑Ala‑Ile‑Val‑Thr‑Arg‑Ile‑Val‑Leu‑Pro‑Trp‑Val‑Arg‑Lys‑Val‑Arg。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽KK26，其特征在于：所述抗菌肽KK26的氨基酸序列为：Lys-Lys-Lys-Ile-Ala-Arg-Tyr-Leu-Asn-Tyr-Gly-Ala-Ile-Val-Thr-Arg-Ile-Val-Leu-Pro-Trp-Val-Arg-Lys-Val-Arg。2.根据权利要求1所述的抗菌肽KK26，其特征在于：所述抗菌肽KK26为α螺旋直链多肽，含有26个氨基酸残基，分子量大小为3141.4Da，等电点为12.13。3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽KK26的应用，其特征在于：所述抗菌肽KK26...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨愈丰，苟洪伟，杨传辉，卢荣锐，夏嫱，李均，刘振勇，彭莉萍，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52