类秋水仙碱化合物的生物转化制造技术

技术编号:1767165 阅读:196 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及利用所选微生物菌株实现的用于制备类秋水仙碱化合物的3-O-糖基衍生物的生物转化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用所选的微生物菌株实现的用于制备类秋水仙碱(colchicinoid)化合物的3-O-糖基衍生物的生物转化方法。具体而言,本专利技术的方法提供了从秋水仙碱、硫代秋水仙碱或其衍生物开始在芳环A的C-3位上专属性地被糖基化的类秋水仙碱化合物。该方法基于由脱甲基化的秋水仙碱中间体决定的糖基化酶的早期活化,导致所得产物的高生产率和高纯度。优选地,本专利技术的方法由多个加料-批次发酵(feed-batch fermentation)过程组成,包括氮源、碳源和待转化底物的分份加料。在苯环的C-3位被糖基化的类秋水仙碱化合物因其高效力而具有非凡的药理学重要性,并且是制备新药的中间体。具体而言,硫代秋水仙碱苷(3-O-糖基硫代秋水仙碱)在药学领域中、主要是在肌肉-骨骼系统疾病的治疗中是具有吸引力和值得关注的活性成分,并且是制备新的抗肿瘤、免疫抑制、抗银屑病和抗炎药物的起始材料。WO98/15642公开了一种从初始浓度不超过1g/l的类秋水仙碱化合物如秋水仙碱、硫代秋水仙碱及其衍生物开始以高转化收率(高达90%)制备类秋水仙碱糖基衍生物的方法。该方法基于初始的与类秋水仙碱的芳环连接的C-3甲氧基的区域选择性脱甲基化步骤以及随后的脱甲基衍生物在相同分子位点的糖基化。本专利技术的方法在保持前者具有相同高转化收率的同时,还使得量大得多的总底物被转化,从而提高了生物转化过程中的总生产率(表示为每批每升所获得的产物总量)和比生产率(specific productivity)(表示为每时间单位(即小时)每升所获得的产物量)。本专利技术的方法特征在于基于诱导特异性酶的糖基化步骤的活化机制。事实上,已经令人惊讶地发现糖基化步骤中所涉及的酶被脱甲基化的类秋水仙碱如3-O-脱甲基秋水仙碱(DMC)或3-O-脱甲基硫代秋水仙碱(DMTC)有效诱导。在生物转化方法的早期阶段或者优选地在预先的种子培养中加入少量(200-600mg/l)3-脱甲基衍生物对糖基化体系的早期活化是有用的。在这种条件下,可以将由脱甲基酶(demethylating enzyme)逐步释放的脱甲基化的中间体有效地转化为最终的糖基衍生物,并且生物转化可以在发酵的最初15-18小时中非常快速地进行。此外,没有显著的中间体累积,这意味着不会抑制脱甲基活性和高转化率。生物转化在18-21小时后完成,因此大大快于已知方法(26-28小时)。转化收率非常高,为80%至100%,通常约90-95%,但是被转化的总底物以及由此产生的终产物大大增加。因此,本专利技术提供了制备具有以下式(I)的3-O-糖基类秋水仙碱化合物的方法, 其中R1是O-糖苷残基,R2是氢或C1-C7酰基,R3是C1-C6烷氧基或C1-C6硫烷基(thioalkyl),所述方法包括利用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)对其中R1是OH或甲氧基的化合物进行生物转化,其特征在于用脱甲基化的类秋水仙碱诱导糖基化酶体系。R1优选为O-糖苷残基。本专利技术的方法的一个优选实施方案包括与氮和碳源例如蛋白胨和葡萄糖组合的底物的多个分份加料。通过确保微生物培养物的稳定生长速率,所述条件使得加入发酵批次中的总底物相应增加(2-4g/l,而非1g/l),并且因此使得该方法的生产率相应增加(每单个批次高达2.5-5.2g/l糖基化产物,而非1-1.2g/l),而且不存在由于未转化底物的大量累积而导致的任何转化效率损失和对细菌培养物的毒性作用的危险。本专利技术还因该方法缩短的时间而具有优点,所述缩短的时间导致培养物的高成活力和有限的细胞裂解,细胞碎片形成减少并对下游处理和产物的回收相当有利。通过使用吸附树脂如XAD 1180(Rohm & Haas)或HP 21(Mitsubishi)可以进一步增强该优点,所述吸附树脂可用于选择性吸附类秋水仙碱化合物和从发酵液中回收的有效产物。另一个优点涉及可通过回收含有产物的终发酵液的主要部分(75%-90%)、向生物反应器中剩余部分的发酵液中加入新的发酵培养基并以新批次开始进行半连续方法。该方法可被扩展至重复的发酵步骤,从而使总生产率成比例增加。此外,除了非凡的生产收率,催化作用的恒定的区域选择性还确保了所得产物的高质量,使得通过简单的下游处理和更少的产物纯化和回收步骤即可得到≥99%的纯度。这方面提示了该方法在溶剂限制和高的环境相容性方面的其他优点。可用于本专利技术的巨大芽孢杆菌与WO98/15642中所述的相同,将该专利申请引入本文作为参考。它们可以在含有有机氮源(蛋白胨、酵母提取物、肉膏、天冬氨酸等)、碳源(甘油、淀粉、麦芽糖、葡萄糖等)、pH5至8、优选6至7的不同琼脂培养基上被选择。孵育温度在20℃至45℃、优选28℃至40℃范围内。用于培养物转化的培养基是典型的微生物学基质,其含有有机氮源(蛋白胨、酵母提取物、胰蛋白胨、肉膏等)、碳源(葡萄糖、麦芽糖、甘油等),pH5至8,优选6至7。孵育温度在20℃至45℃、优选28℃至40℃范围内。可以在如本专利技术所述加入的类秋水仙碱化合物的存在下测定所选微生物在深层培养中生长的能力和将类秋水仙碱化合物转化为相应的3-糖基衍生物的能力。在含有20ml液体培养基的100ml烧瓶中用不同的培养基配方进行所述测定,所述培养基配方包含一种或多种有机氮源(酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、肉膏、玉米浆等)、一种或多种碳源(葡萄糖、甘油、淀粉、蔗糖等)、无机磷和氮源以及各种离子(K+、Na+、Mg++、Ca++、Fe++、Mn++等)的无机盐。可以将培养物样品任选地利用常规诱变技术(用UV线照射等)进行诱变处理,以诱导具有特异性生物转化活性的突变体,所述特异性生物转化活性可以用与上述相同的方法进行评价。在烧瓶中以300ml的规模利用生物转化测定已经证实了所选细菌将类秋水仙碱底物转化为各自的3-糖基衍生物的能力,所述类秋水仙碱底物与碳和氮源一起以重复的小份被加入培养液中,烧瓶中含有不同的培养基配方,其包含一种或多种有机氮源(酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、肉膏、玉米浆等)、一种或多种碳源(葡萄糖、甘油、淀粉、蔗糖等)、无机磷和氮源以及各种离子(K+、Na+、Mg++、Ca++、Fe++、Mn++、NH4+等)的无机盐。细菌生长和生物转化由一种或多种有机氮源支持,优选肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆等。可用于生长和生物转化的碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、麦芽汁等,优选葡萄糖、果糖和甘油。此外,培养基还含有无机磷源和K+、Na+、Mg++、Mn++、NH4+等的盐。可用于过程中加料的碳源优选为葡萄糖和果糖。用于过程中加料的氮源优选为有机源如蛋白胨、酪蛋白水解物、胰蛋白胨或无机源如硫酸铵或二者的组合。初步实验显示,在生物转化步骤前引入深层种子培养物(其含有与生产培养基相似的培养基配方)导致在生物转化开始时有非常均匀且高度活跃的微生物群。已经使用不同发酵参数如底物添加的量、时间和方式、加料比、孵育时间、接种物比等进行了额外的实验。在生物转化步骤开始时或更好地在预先的种子培养期间早期加入脱甲基类秋水仙碱作为诱导物可大大提高该方法的转化效率和总生产率。通过与碳源和氮源组合在本方法期间将待转化的底物以更多本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备具有以下式(Ⅰ)的3-O-糖基类秋水仙碱化合物的方法,    ***    其中R↓[1]是O-糖苷残基,R↓[2]是氢或C↓[1]-C↓[7]酰基,R↓[3]是C↓[1]-C↓[6]烷氧基或C↓[1]-C↓[6]硫烷基,所述方法包括利用巨大芽孢杆菌(Bacillus  megaterium)对其中R↓[1]是OH或甲氧基的化合物进行生物转化,其特征在于用脱甲基化的类秋水仙碱诱导糖基化酶体系。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员:C蓬佐内
申请(专利权)人:因德纳有限公司
类型:发明
国别省市:IT[意大利]

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