一种枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ）的菌种保藏编号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１９８２。该菌株制成的干粉菌剂可用于防治由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核病菌、黄瓜炭疽病菌等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、葡萄、梨等水果保鲜领域。经菌悬液处理后的水稻、玉米叶片，均不能出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理后的黄瓜种子或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用，有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低，贮存期延长。该菌剂制备工艺简单，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用，属于一种广谱生防、促 生菌剂。
技术介绍
半个多世纪以来，化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。 但是，随着化学农药的长期和大量使用带来的农药残留、环境污染、病虫的 抗药性等问题的出现，化学农药的安全性引起了社会的普遍关注，生物防治 越来越受到人们的重视。生物防治具有对人畜安全，无毒害，不污染环境等 优点，逐渐成为植物病虫害防治的重要措施之一。在植物病虫害生物防治中，尤以苏云金芽孢杆菌(Bt)防治鳞翅目害虫最为成功。目前，开发利用生物 杀菌剂防治农作物病害已成为生防领域的研究热点。在该领域，具有防病效 果的微生物包括芽孢杆菌、木霉、放线菌等，其中以枯草芽孢杆菌的研究 开发最为活跃，在微生物杀菌剂市场中备受瞩目。枯草芽孢杆菌是一种在自 然界广泛存在的微生物，革兰氏阳性，产生耐热、抗逆的芽孢，在芽孢形成 初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，具有显著的生防 潜力。枯草芽孢杆菌具生长快、营养简单，有利于生防菌剂的生产、剂型加 工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低， 施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前已明确的枯草芽孢杆 菌作为生物杀菌剂的抑菌机制有以下几个方面 一是营养和空间位点的竞争; 二是分泌抗菌物质。目前已确定来自枯草芽孢杆菌的抗菌物质有低分子抗菌 肽，有环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽等，这些物质能使病原真菌菌丝 发生断裂、解体、细胞质消解等现象；三是促进植物生长，增强植物的诱导 抗病性。尽管很多枯草芽孢杆菌生防制剂已被证实具有防治作用，但仅有少 数几种应用于生产，大部分仍处于研究和探索阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株以及该菌株的干粉菌剂在 农业病害防治、水果保鲜等领域中的应用。 本专利技术的目的是通过以下方式实现的本专利技术人从田间玉米病叶片上分离到一株对玉米小斑病菌C小种有拮抗 作用的细菌菌株，经鉴定属于典型的枯草芽孢杆菌(J5 "7/m s"^/fc)，但与其它枯草芽孢杆菌相比其具有广谱抗病原真菌活性，同时其干粉菌剂对鲜桃、 葡萄等水果保鲜效果较好，用于黄瓜、番茄、等大棚蔬菜的生产不仅有抗病 效果，而且又有促生作用。为了证明该菌株的广谱抗病原真菌活性，专利技术人做了以下工作一、枯草芽孢杆菌CGMCCNo.l982菌株的鉴定、诱变及拮抗机理1、 菌株的形态显微镜下观察发现，该菌株菌体杆状，产生芽孢，革兰氏反应为阳性。 在TSA培养基上菌落呈浅黄色，近圆形，表面干燥、有褶皱，不透明。2、 菌株的生理生化特征生理生化实验鉴定表明，该菌株为好氧菌，接触酶阳性，V-P实验阳性， 能产生淀粉酶，对盐有一定的耐受性；不能利用丙二酸盐；不产生卵磷脂酶。3、 菌株16SrDNA序列的测定利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA序列，获1514 bp全长片段。将 测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA进行同源性比较，发现与fi"d〃附 s"M//5 (登录号AY887082)的同源性最高，为99%。根据菌体革兰氏染色、菌落形态特征的观察、生理生化测试及16SrDNA序列分析结果，该菌株和枯草芽孢杆菌相吻合，因此将其鉴定为枯草芽孢杆 菌(5fl"7/ws )。4、 菌株的复合诱变及抗菌活性提高采用紫外线和氯化锂对菌株进行复合诱变处理，获得了遗传性状稳定的 诱变菌株，其对致病真菌玉米小斑病菌的拮抗活性比出发菌株提高了66.2%。5、 菌株拮抗物质的理化特性分析将菌株接种于LB液体培养基，3(TC振荡培养48h，用高速离心机12， 000 r/min离心5 min去菌体，上清液加入30 %饱和度的硫酸铵，4 'C静置过夜后，12， 000 r/min离心25 min，取上清液，加入硫酸铵使达到60 %饱和度， 4 T:静置过夜后，12， 000 r/min离心25 min，得到具拮抗活性的蛋白性质粗提 物。对拮抗物的理化特性分析表明，菌株产生的拮抗物质能耐高温(100'C， lOmiii)，抑菌活性pH值范围为5.0 9.0，对紫外线、胰蛋白酶部分敏感， 对蛋白酶K、氯仿敏感，说明该拮抗蛋白稳定性较好。6、菌株拮抗物质的拮抗机理以玉米小斑病菌(说>>/ /^ m^^W作为指示菌，对菌株产生的拮抗物质的 作用机制进行了初步研究，结果表明拮抗物质可使玉米小斑病菌孢子不萌 发或萌发异常；菌丝畸形，顶端及中部膨大、扭曲，细胞质分布不均匀。 二、枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.1982干粉菌剂的制备1、 液体发酵培养(1) 菌种活化采用的培养基含胰蛋白胨，大豆蛋白胨，NaCI ，水。 将保存的甘油菌种接到活化培养基固体斜面后，34'C培养48h。(2) 种子培养采用的培养基含酵母膏，葡萄糖，CaC03，水。 将活化的斜面菌种用无菌水冲洗，制成菌悬液，按下列条件接到种子培养基中培养，培养温度35'C，摇瓶装量12%,接种量3%，初始pH值7.2。(3) 菌株补料分批发酵工艺 发酵培养基含葡萄糖，酵母膏，CaC03。 流加培养基含葡萄糖，酵母膏，制成混合液一起流加； 流加时间发酵8h后开始；发酵时间34±2 h; 发酵液芽孢浓度(3.41±0.151) xl09cfu/mL。2、 菌体的制备发酵得到的发酵液12000 r/min离心20min，弃上清，菌体加入无菌水悬 浮混匀，再12000 r/min离心15 min，弃上清得菌体。3、 干粉菌剂的制备菌体称重后，称等重量的无水CaC03， CaC03缓慢加入湿菌体中，边加 边搅拌，直至均匀。于真空干燥箱中5(TC烘干30min至粉末状。干粉菌剂 中活芽孢数为2.109士(U66)xl011 cfu/g。三、枯草芽孢杆菌CGMCC No.l982干粉菌剂在农业病害防治、水果保 鲜等领域的应用本专利技术用于农业病害防治、水果保鲜的枯草芽孢杆菌< "7//附s"Z^7W 菌株CGMCC No.l982干粉菌剂的组成为湿菌体与无水碳酸钙的质量比为 1: 1,菌剂中的活芽孢数含量为200 500亿/克。上述干粉菌剂还可以制备成干粉水溶液(菌悬液)，制备方法是称取0.1 g 干粉菌剂溶于100mL水中，或干粉菌剂与水的质量体积比为l: 1000，搅拌 均匀得菌悬液，菌悬液活芽孢数为1.0xi()Scfu/mL。 (1.0 xl08cfu/mL)o本专利技术取得的积极效果是本专利技术的菌株CGMCC No. 1982可用于防治 由小麦赤霉病菌、水稻稻瘟病菌、玉米小斑病菌、黄瓜炭疽病菌、大蒜菌核 病菌、辣椒炭疽病菌桃等引起的农作物、蔬菜等病害；还可应用于桃、苹果、 葡萄、梨等水果保鲜领域。经干粉水溶液处理后的水稻、玉米叶片，均不能 出现相应的病斑；用粉剂拌种、粉剂根埋或菌悬液喷洒方式处理的黄瓜种子 或幼苗叶片，不仅可防止黄瓜炭疽病的发生，而且表现出良好的促生作用， 有利于绿色、无公害蔬菜的生产。经菌悬液处理后的鲜桃，烂果率明显降低， 贮存期延长。本专利技术的干粉菌剂在农业病害防治、水果保鲜等领域展现出较 好的应用前景。本专利技术的枯草芽孢杆菌粉剂中芽孢含量明显高于市场上现有 的产品，而且其制备工艺简单，适合工业化生产。该菌株于2007年3月21本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株，其特征在于在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：ＣＧＭＣＣＮｏ．１９８２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王立安，成丽霞，李小俊，彭兵，贾宇，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]