一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途，其中，所述特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞细胞包括NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其制备方法是将含有NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因的慢病毒和含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因的慢病毒同时感染自然杀伤细胞。本发明专利技术特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞通过所含的NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因共同作用，提高了该自然杀伤细胞的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，增加了该自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免了肿瘤免疫的逃逸，从而增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

A natural killer cell modified by a specific chimeric antigen receptor gene and its preparation methods and uses

The invention discloses a specific chimeric antigen receptor gene modified NK cell and its preparation method and application thereof, wherein, the natural killer cell specific chimeric antigen receptor gene modified NY ESO 1 specific chimeric antigen receptor gene and truncated spleen tyrosine kinase Syk gene. The preparation method is containing NY ESO 1 specific chimeric antigen receptor gene and lentivirus containing truncated spleen tyrosine kinase Syk gene lentiviral infection and natural killer cells. The present invention specific chimeric antigen receptor gene modified NK cells through interaction with NY ESO 1 specific chimeric antigen receptor gene and truncated spleen tyrosine kinase Syk gene, improve the natural killer cell targeting specific tumor cell destruction, increase the capacity of the natural killer cell activation signal, avoid the tumor immune escape, thereby enhancing the cytotoxicity to tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物制药
，特别涉及一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
自然杀伤细胞(NK细胞)是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞具有较强的非特异性直接杀伤靶细胞的能力，并且这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。NK细胞通过多种细胞表面受体(例如NKG2D，CD16)以及天然细胞毒性受体(NKp44，NKp46，NKp30)识别被感染的和恶性癌变的细胞。这些受体激活含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)结构的调控蛋白DAP10、DAP12，ITAM能启动细胞毒性颗粒蛋白的释放，并调控IFN-γ和TNF-α等细胞因子和趋化因子的分泌。脾酪氨酸激酶(Syk)是调控蛋白DAP12关键的下游蛋白酪氨酸激酶，当胞外受体与其配体相互作用时，ITAM被酪氨酸激酶磷酸化，招募Syk，进一步磷酸化下游蛋白传递活化信号，从而激活NK细胞发挥作用。近年来，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞技术在治疗血液系统肿瘤的临床应用中取得了显著的突破，在临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性。但是，最新的临床实验中发现CAR-T技术具有引起细胞因子风暴及系统性神经毒性等高风险因素。另外，由于肿瘤微环境的免疫抑制及免疫逃逸作用，CAR-T细胞在实体瘤治疗方面尚未获得明确疗效。NK细胞由于其特点：发挥杀伤作用不需要预先致敏，也不受主要组织相容性复合物的限制，可以使用异体来源的NK细胞而不会在受试者(患者)体内引起排异反应；不会产生细胞因子风暴(比如，不会发生白细胞介素-6的大量释放)。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。癌-睾丸抗原(CT)被认为最具有前景的肿瘤相关抗原之一，其特点是在多种组织来源的肿瘤细胞中表达，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织。由于生殖细胞不表达HLA分子，以及血睾屏障的存在，因此针对CT抗原的肿瘤免疫治疗一般不会对正常组织细胞产生免疫毒性。NY-ESO-1(NewYorkesophagealsquamouscellcarcinoma1)是CT抗原基因家族中的重要一员，由于其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，并在多种肿瘤组织(恶性黑素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等)中表达而在肿瘤治疗领域备受关注。尽管如今出现了一些含有与NY-ESO-1特异结合的特异受体的转基因NK细胞，但大部分用于NK细胞中表达的CAR都是仅有T细胞CD3ζ结构域的一代CAR载体，与NK自身兼容性不高，同时增大转染后NK细胞的负荷，使得转染效率偏低；另外，由于肿瘤逃逸机制的存在，使得该转基因NK细胞激活下游信号不足，降低了当前转基因NK细胞的杀伤效果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，旨在解决现有的转基因自然杀伤细胞由于肿瘤逃逸机制的存在，而导致该转基因自然杀伤细胞激活下游信号不足的技术问题。为实现上述目的，本专利技术提出的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。优选地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段中。优选地，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因序列参见表1。优选地，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。本专利技术还提出一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，其中，所述第一慢病毒含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，所述第二慢病毒含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。优选地，所述第一慢病毒按照如下方法获取：将NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段与入门载体混合，以使所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体；将所述带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒；将所述癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第一慢病毒。优选地，所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法包括以下步骤：获取NY-ESO-1抗原免疫总cDNA；将所述NY-ESO-1抗原免疫总cDNA与NY-ESO-1抗体重链可变区VH引物及轻链可变区VL引物进行PCR，获得NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段；将所述NY-ESO-1VH和NY-ESO-1VL基因片段采用连接肽连接，获得NY-ESO-1抗体scFv基因片段；将是NY-ESO-1抗体scFv基因片段与pcDNA载体连接，获得pcDNA-NY-ESO-1/scFv质粒；将按照CD8α、41BB及DAP12-ITAM序列基因序列设计合成嵌合抗原受体的CD8-41BB-DAP12表达框，用HindIII/XhoI酶切后克隆进pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv质粒，获得pcDNA3.1(+)-NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12质粒，EcoRI/XhoI酶切后获得NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段。优选地，所述第二慢病毒按照如下方法获取：获取截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列；将截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列与入门载体混合，以使所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列嵌入所述入门载体，而获得带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列的入门载体；将所述带有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以得到慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk；将所述慢病毒表达质粒pLenti7.3-Syk与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第二慢病毒。优选地，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。本专利技术还提出一种肿瘤药物制剂，该肿瘤药物制剂包括本专利技术的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞或者由本专利技术的制备方法制备的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞。本专利技术特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。其中，本专利技术特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞由于含有所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，因而具有较强的靶向肿瘤细胞特异性杀伤性，同时由于它能够过表达截短型脾酪氨酸激酶Syk基因，因而可以增加本专利技术特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞激活下游信号的能力，避免肿瘤的免疫逃逸。因此，本专利技术特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞具有较强的靶向肿瘤细胞特异杀伤性，能够有效避免肿瘤免疫的逃逸，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，包括NY‑ESO‑1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。

【技术特征摘要】
1.一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，包括NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因和截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。2.如权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因设于NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段中。3.如权利要求2所述的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因序列参见表1。4.如权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，所述截短型脾酪氨酸激酶Syk基因序列参见表2。5.一种特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：将第一慢病毒和第二慢病毒同时感染NK细胞，其中，所述第一慢病毒含有NY-ESO-1特异性嵌合抗原受体基因，所述第二慢病毒含有截短型脾酪氨酸激酶Syk基因。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一慢病毒按照如下方法获取：将NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段与入门载体混合，以使所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段嵌入所述入门载体，而获得带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体；将所述带有NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的入门载体与慢病毒质粒混合重组，以建立癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒；将所述癌-睾丸抗原NY-ESO-1特异性NK细胞受体表达质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞，获得第一慢病毒。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述NY-ESO-1/scFv-CD8-41BB-DAP12基因片段的获取方法包括以下步骤：获取NY-ESO-1抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44