表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途技术

本文报道表达载体，其包含‑抗体轻链表达盒，‑抗体重链表达盒和‑选择标记表达盒，其中该表达盒单向排列，且其中该表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。本文还报道用于产生生产抗体的细胞的方法，和这些细胞用于重组产生抗体的用途。

Expression of carrier tissue, new production method of production cell and its use in recombinant peptide production

This paper reports the expression vector, which contains light chain antibody expression cassette antibody heavy chain expression cassette and marker expression box, wherein the expression box of one-way permutations, and wherein the expression box according to the antibody heavy chain and light chain antibody expression cassette expression cassette and marker expression cassette 5 'to 3' order. This article also reports on the methods used to produce cells producing antibodies, and the use of these cells for recombinant production of antibodies.

【技术实现步骤摘要】
表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途本申请是申请人于2012年12月19日提交的题为“表达载体组织、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途”的中国专利申请201280062794.3的分案申请。本文报道新的表达载体组织，用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
技术介绍
基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响：启动子、polyA信号序列和(如果存在)转录终止子。编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约57bp/19aa)、可变区VH(约350bp/115aa)和恒定区CH(约990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区VK或VL(约350bp/115aa)和恒定区CK或CL(约321bp/107aa)组成。在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见McCafferty,J.等,(编辑),AntibodyEngineering,APracticalApproach,IRLPress(1997))。为了发展抗体表达系统，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化(polyA)区。同样，产生包含重链编码核酸的重链表达盒，该重链编码核酸侧翼是启动子和polyA区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达盒，或者可以整合入两个分开的载体。US7,053,202中报道了免疫球蛋白DNA盒分子、单体(monobody)构建体、产生方法及其使用方法。在US5,168,062中，报道了含有人巨细胞病毒立即早期启动子调节DNA序列的转移载体和微生物。US5,225,348中报道了含有人多肽链延伸因子-1α的启动子区的DNA片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的DNA片段的表达质粒。在US5,266,491中，报道了含有SV40复制起点及具有人多肽链延伸因子-1α基因的启动子区的DNA片段的表达质粒。US5,122,458中报道了重组DNA化合物和诸如tPA的多肽的表达。在US7,422,874中，报道了用于动物细胞的表达载体。Kim,D.等报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物细胞表达系统(Biotechnol.Prog.19(2003)1620-1622)。Chappell,S.A.等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)1536-1541报道了细胞mRNA的9-nt区段可以作为内部核糖体进入位点(IRES)发挥作用，且在存在于连接的多拷贝中时极大地增强IRES活性。Corish,P.和Tyler-Smith,C.报道了减弱绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中的半衰期(Prot.Eng.12(1999)1035-1040)。Primig,M.等(Gene215(1998)181-189)报道了设计用于在转染的哺乳动物细胞中分离和分析增强子元件的新的GFPneo载体。Ng,S.K.等报道了将不稳定序列应用于选择标记来改进CHO-DG44细胞中的重组蛋白质生产力(Metabol.Eng.9(2007)304-316)。SannaPietro,P.报道了抗体Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达(Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395)。Higuchi,K.等(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)报道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗体的可变区的基因克隆的细胞展示文库。Kim,D.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达系统(Biotechnol.Progress19(2003)1620-1622)。Costa,R.A.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138)报道了用于单克隆抗体产生的细胞工程的指导。Kim,D.W.等报道了用人延伸因子1α启动子作为通用和有效的表达系统(Gene91(1990)217-223)。Buchman,A.R.等(Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405)报道了依赖内含子和不依赖内含子的基因表达的比较。Wang,F.等报道了哺乳动物细胞中的抗体表达(在Therapeuticmonoclonalantibodies–Frombenchtoclinic,Wiley(2009)557-572页中)。Li等(J.Immunol.Meth.318(2007)113-124)报道了用于重组IgG抗体的哺乳动物表达的不同载体设计的比较性研究。Ho,S.C.L.等报道了用于增强高单克隆抗体表达CHO细胞系的产生的IRES介导的三顺反子载体(J.Biotechnol.157(2011)130-139)。Hotta,A.等(J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303)报道了通过重组动物细胞产生抗-CD2嵌合抗体。Lee,J-C.等报道了肠道病毒71内部内糖体进入位点介导的高效蛋白质表达(Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662)。在WO2008/142124中，报道了Avian细胞中的重组蛋白质产生。专利技术概述已发现，对于抗体的重组产生，与相反的顺序(LC-HC(5’-3’))相比，重链表达盒放置在轻链表达盒前面(HC-LC(5’-3’))提供更好的表达结果。此外，已发现，与第一抗体链前面的双向位置(SM(3’-5’)-HC-LC(5’-3’))相比，选择标记放置在两个抗体链表达盒后面提供更好的表达结果(HC-LC-SM(5’-3’))。已发现，对于稳定转染，1)抗体重链、2)抗体轻链和3)选择标记的成行排列是最佳的。虽然hEF1α启动子在稳定库中明显优于hCMV启动子，但我们已看见对单克隆水平的明显相反的作用。在此，人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(hCMV)产生了具有最高的生产力克隆。此外，其性能可以进一步通过将它与bGHpolyA信号和人胃泌素基因(hGT)的终止子序列组合来改善，其提高生产力和表达稳定性二者。已发现，如果1)启动子是人巨细胞病毒启动子(hCMV)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGHpolyA)，且终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hGT)，或2)启动子是人延伸因子1α启动子(EF1α)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGHpolyA)，且终止子序列缺乏，则包含各含有启动子、结构基因和polyA信号序列及可选的终止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的产生/分泌抗体的细胞克隆。通过使用上述表达载体，可以在转染后获得更高数目的产生/分泌抗体的细胞，从而减少了鉴定适合用于大规模重组抗体产生的高产细胞所需的努力。本文报道的一个方面是表达载体，其包含：-抗体轻链表达盒，-抗体重链表达盒，和-选择标记表达盒，其中该表达盒单向排列，和其中该表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达载体，其包含：‑抗体轻链表达盒，‑抗体重链表达盒，和‑选择标记表达盒，其中该表达盒单向排列，和其中该表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。

【技术特征摘要】
2011.12.22 EP 11195363.41.表达载体，其包含：-抗体轻链表达盒，-抗体重链表达盒，和-选择标记表达盒，其中该表达盒单向排列，和其中该表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。2.权利要求1的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记表达盒相互独立地包含选自人延伸因子1α启动子、人CMV启动子和SV40启动子的启动子。3.权利要求1或2的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒包含人延伸因子1α启动子。4.权利要求1-3任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地包含人延伸因子1α启动子。5.权利要求1-4任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒不包含终止子序列。6.权利要求5的表达载体，其特征在于所述终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hGT)。7.权利要求1或2的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒包含人CMV启动子。8.权利要求1、2和7任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地包含人CMV启动子。9.权利要求1-4和7-8任一项的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒包含牛生长激素polyA信号序列。10.权利要求1-4和7-9任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地包含牛生长激素polyA信号序列。11.权利要求1-4和7-10任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地包含选自牛生长激素polyA信号序列和SV40polyA信号序列的polyA信号序列。12.权利要求1和7-11任一项的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒在所述polyA信号序列后面包含人胃泌素终止子序列。13.权利要求1和7-12任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地在polyA信号序列后面包含人胃泌素终止子序列。14.权利要求1和7-13任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒和/或所述抗体重链表达盒和/或所述选择标记盒相互独立地按5’至3’方向包含牛生长激素polyA信号序列和人胃泌素终止子序列。15.权利要求1-14任一项的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒的启动子包含内含子A。16.权利要求1-8和12-13任一项的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒包含SV40polyA信号序列。17.权利要求16的表达载体，其特征在于一个、两个或全部三个表达盒包含SV40启动子。18.权利要求1-17任一项的表达载体，其特征在于编码抗体轻链的核酸和/或编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。19.权利要求1-18任一项的表达载体，其特征在于编码抗体轻链的核酸和/或编码抗体重链的核酸是cDNA。20.权利要求1-19任一项的表达载体在重组产生抗体中的用途。21.权利要求1-19任一项的表达载体在产生稳定细胞系中的用途。22.权利要求1-19任一项的表达载体在产生生产细胞系中的用途。23.权利要求1-19任一项的表达载体在产生稳定细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。24.权利要求1-19任一项的表达载体在产生生产细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。25.权利要求1-19任一项的表达载体在重组产生抗体中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人延伸因子1α启动子的表达盒。26.权利要求1-19任一项的表达载体在产生生产细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人CMV启动子的表达盒。27.权利要求1-19任一项的表达载体在产生稳定细胞系中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人CMV启动子的表达盒。28.权利要求1-19任一项的表达载体在产生抗体中的用途，所述表达载体包含至少一个含有人CMV启动子的表达盒。29.用表达载体转染真核细胞的方法，其特征在于转染之前，通过在原核复制起点中切割来线性化表达载体。30.权利要求29的方法，其特征在于原核复制起点在抗体轻链表达盒和抗体重链表达盒之间。31.权利要求29或30的方法，其特征在于所述表达载体是权利要求1-19任一项的表达载体。32.选择包含抗体编码核酸的真核细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·许尔斯曼，H·克内根，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH