一种制备利拉鲁肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种固相法制备利拉鲁肽的方法，包括通过Glu侧链羧基进行固相支载，合成氨基酸树脂Fmoc‑Glu(Resin)‑OAll；以Fmoc‑Glu(Resin)‑OAll为起始树脂合成肽树脂中间；偶联片段，制得利拉鲁肽肽树脂；利拉鲁肽肽树脂经酸性条件裂解、HPLC纯化、冷冻干燥后制得高纯度利拉鲁肽。本发明专利技术所采用的支载方法由于Glu侧链相对较长，从而起到了肽链和树脂间连接桥(Linker)的作用，增加了肽链与树脂之间的柔性。使肽链更容易变形而降低反应位阻，从而提高合成反应效率。

A method for preparation of liraglutide

The invention discloses a method for preparing solid Liraru peptides, including solid supported by the Glu side chain carboxyl, amino acid synthetic resin Fmoc Glu (Resin) OAll to Fmoc; Glu (Resin) OAll as intermediate starting resin synthetic peptide resin; coupling fragment prepared Liraru peptide resin; Liraru peptide resin under acidic conditions HPLC lysis and purification, freeze drying of high purity Liraru peptide. The supporting method used in the invention is due to the relatively long side chain of Glu, thus playing the role of Linker between peptide chain and resin, increasing the flexibility between peptide chain and resin. The peptide chain is more easily deformed and the reaction position is reduced, thus the efficiency of synthetic reaction is improved.

【技术实现步骤摘要】
一种制备利拉鲁肽的方法
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的制备方法。。
技术介绍
糖尿病是一种全球性疾病，据报道2014年全球共有糖尿病患者4.22亿人，约占全球人口的8.5％，其中II型糖尿病占约90％。利拉鲁肽是一种用于治疗II型糖尿病的人胰高血糖素样-1(GLP-1)的修饰物，具有GLP-1受体激动作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。利拉鲁肽属于新一代肠促胰岛素降血糖药物，作用时间长，并可能对多种心血管危险因素具有正面作用。利拉鲁肽的上市为患者增加了一种更人性化的降糖治疗选择。利拉鲁肽英名为Liraglutide，其结构式为：利拉鲁肽分子结构与GLP-1(7-37)具有97％同源性。不同处在于以Arg替代Lys34；Lys26侧链氨基经过Nα-棕榈酰经过γ-谷氨酰化。长链脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血液中与白蛋白可逆性地结合，从而降低了被DPP-IV水解的速率和肾清除率，从而延长生物半衰期到11～15h，每天只需皮下注射一次，提高了患者的顺应性。利拉鲁肽由诺和诺德公司通过基因重组技术和化学修饰生产并上市，专利CN1271086A、CN1951965A、CN100569798A。专利CN102286092A、CN103145828A、CN103980358A、CN103304660A等记载了通过固相氨基酸偶联法合成利拉鲁肽,此类方法操作简单，但面临肽树脂增长过程中，困难序列形成导致合成效率低下的缺点，所得粗品纯度低、纯化操作步骤多且杂质不易控制等问题，且合成周期相对较长。专利CN102875665A、CN104045705A、CN103304659A、CN103864918A、CN104004083A、WO2016/067271A1等公开了通过片段法结合固相法合成利拉鲁肽，该固相法合成利拉鲁肽都是通过主链碳端氨基酸Gly支载于固相树脂。此类方法合成的利拉鲁肽粗品相对容易纯化，且合成周期有所缩短。但由于其固相树脂支载位置，处于肽链碳端位置，使得整条肽链更易扭曲、空间位阻增大而造成后续偶联效率下降。专利CN103864918A、WO2014/199397A2等则通过固相法合成片段，然后在液相中，进行片段组合连接合成利拉鲁肽。此类方法合成利拉鲁肽粗品容易纯化，生产周期较短，但前期片段合成和纯化工作量巨大。
技术实现思路
：本专利技术的目的是结合现有化学合成技术各项优点，提供一种首次将固相树脂支载于利拉鲁肽21位Glu侧链羧基上进行利拉鲁肽肽树脂的固相法合成，使固相树脂载体处于肽链接近中部位置，示意图如图3所示。如
技术介绍
所述，现有固相合成利拉鲁肽的技术，都是将树脂支载于肽链碳端进行接肽反应合成利拉鲁肽肽树脂，示意图如图4所示。本专利技术所采用的支载方法由于Glu侧链相对较长，从而起到了肽链和树脂间连接桥(Linker)的作用，增加了肽链与树脂之间的柔性。使肽链更容易变形而降低反应位阻，从而提高合成反应效率。为实现专利技术目的，本专利技术采取如下的技术方案：一种利拉鲁肽的制备方法，包括通过Fmoc固相法将Glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到Fmoc-Glu(Resin)-OAll氨基酸树脂I；再通过多步骤固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树脂：Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu最后在酸性条件下裂解、色谱纯化、冷冻干燥制备得到高纯度利拉鲁肽；其中Pg2为Trt或Boc；其中羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂；CTC树脂优选为2-Cl-Trityl-Cl树脂、4-Methyl-Trityl-Cl树脂、4-Methoxy-Trityl-Cl树脂。作为优选，所述的利拉鲁肽肽树脂由Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂IV)和H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu(片段IV)合成。作为优选，所述肽树脂IV通过Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂III)合成得到；其中所述Pg1为Dde或iVDde。作为优选，所述肽树脂III通过肽树脂Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)合成得到；所述肽树脂Ⅱ通过Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)合成得到。具体的，本专利技术关于一种利拉鲁肽的制备方法包括如下步骤：步骤1通过Fmoc-Glu-OAll与树脂(Resin)反应合成Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)；步骤2通过Trityl-Cl树脂合成Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH(片段II)，碳端叔丁酯化、去Fmoc后得H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(片段IV)；步骤3Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)在去保护液作用下脱去保护基Fmoc后，在活化剂系统存在下与Fmoc-Lys(Pg1)-OH偶联得Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)；步骤4Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll肽树脂Ⅱ脱除Fomc后，在活化剂系统存在下与Fmoc-Ala-OH偶联得Fmoc-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OALL，继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Pg2)OH得Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅲ)；步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括通过Fmoc固相法将Glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到Fmoc‑Glu(Resin)‑OAll氨基酸树脂I；再通过多步骤固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树脂：Boc‑His(Pg2)‑Ala‑Glu(tBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(tBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(tBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys(N

【技术特征摘要】
1.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括通过Fmoc固相法将Glu侧链羧基支载到羟基类型树脂上得到Fmoc-Glu(Resin)-OAll氨基酸树脂I；再通过多步骤固相偶联反应合成利拉鲁肽肽树脂：Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu最后在酸性条件下裂解、色谱纯化、冷冻干燥制备得到高纯度利拉鲁肽；其中Pg2为Trt或Boc；其中羟基类型树脂为Wang树脂或对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂；Trityl-Cl类型树脂优选为2-Cl-Trityl-Cl树脂、4-Methyl-Trityl-Cl树脂、4-Methoxy-Trityl-Cl树脂。2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述的利拉鲁肽肽树脂由Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Nα-Pal-γ-Glu-OtBu)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂IV)和H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-Otbu(片段IV)合成。3.根据权利要求2所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述肽树脂IV通过Boc-His(Pg2)-(2-19)-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂III)合成得到；其中所述Pg1为Dde或iVDde。4.根据权利要求3所述的一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于所述肽树脂III通过肽树脂Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)合成得到；所述肽树脂Ⅱ通过Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)合成得到。5.一种利拉鲁肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1通过Fmoc-Glu-OAll与树脂(Resin)反应合成Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)；步骤2通过Trityl-Cl树脂合成Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OH(片段II)，经过碳端叔丁酯化、去Fmoc后H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-OtBu(片段IV)；步骤3Fmoc-Glu(Resin)-OAll(氨基酸树脂I)在去保护液作用下脱去保护基Fmoc后，在活化剂系统存在下与Fmoc-Lys(Pg1)-OH偶联得Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(肽树脂Ⅱ)；步骤4Fmoc-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll肽树脂Ⅱ脱除Fomc后，在活化剂系统存在下与Fmoc-Ala-OH偶联得Fmoc-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OALL，继续重复脱Fmoc和偶联操作，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Pg2)OH得Boc-His(Pg2)-Ala-Glu(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pg1)-Glu(Resin)-OAll(...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓航，刘志国，纪东亮，秦德志，
申请(专利权)人：杭州湃肽生化科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33