一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法技术

本发明专利技术提供一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，包括以下步骤：芦笋花药的获取、芦笋花药的预处理、芦笋花药愈伤组织诱导、芦笋花药继代分化、试管苗生根、单倍体染色体加倍。本发明专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，芦笋花药的质地坚硬紧密的愈伤组织的诱导率为7.2‑17%；特别是品种“冠军”的质地坚硬紧密的愈伤组织诱导率为15.8‑17%以上。本发明专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，单倍体分化率为2.2‑7.2%，由单倍体诱导得到纯合二倍体和多倍体的成功率为45.86‑49.73%，其中纯合二倍体占比为1.6‑2.9%。

A method of obtaining asparagus homozygous diploid by anther culture

The present invention provides a method for using anther culture of asparagus homozygous diploid, which comprises the following steps: Asparagus anther acquisition, asparagus anther pretreatment, anther callus induction, subculture and differentiation of anther haploid chromosome doubling, Miao Shenggen tube. The use of anther culture method to obtain homozygous diploid asparagus, asparagus anther texture hard compact callus induction rate was 7.2 17%; especially the variety \champion\ of hard compact callus induction rate was 15.8 above 17%. The use of anther culture method to obtain asparagus homozygous diploid and haploid differentiation rate was 2.2 7.2%, by induction of haploid obtained homozygous diploid and polyploid success rate was 45.86 49.73%, the homozygous diploid accounted for 1.6 2.9%.

【技术实现步骤摘要】
一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法
本专利技术涉及植物育种
，尤其涉及一种通过芦笋花培途径培育纯合二倍体超雄株和雌株。
技术介绍
芦笋学名石刁柏（AsparagusofficinalisL.），嫩茎质地细腻，纤维柔软可口，风味鲜美，有独特的芳香味。含有丰富的多糖、黄酮类化合物、皂甙等活性成分，芦笋具有抗肿瘤、抗疲劳、降血压、降血脂、提高免疫功能等作用，是一种营养价值极高的保健蔬菜，已被列为世界“十大名菜”之一，在国际市场上享有“蔬菜之王”的美称。目前芦笋常规品种选育的途径为：先选择性状优良的雄株和雌株进行杂交；选择强杂种优势组合，然后进行3-4年多点田间品比试验，通过田间综合性状调查，最终选育出新品种。由于芦笋雌雄异株的特殊性，与雌雄同花的作物相比，缺少了自交这一环节，从而造就目前芦笋品种存在一致性、稳定性差的特点，同一品种不同单株，甚至同一单株不同笋条之间都存在差异。目前国内已报道的芦笋花药培养研究工作大多局限于影响花药愈伤组织诱导率的因素及植株再生，而后续的单倍体鉴定、单倍体染色体加倍、超雄株鉴定等的相关研究却较少，也没有成功培育出纯合二倍体的报道。现有技术进行芦笋花药愈伤组织诱导和植株再生研究中存在以下技术问题：（1）芦笋花药培养的效率不高，愈伤组织诱导率低；（2）体细胞干扰严重、花粉单倍体出现频率低。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，以实现以下专利技术目的：（1）提高芦笋花药愈伤组织的诱导率；（2）克服体细胞的干扰、提高花粉单倍体出现的频率；为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案如下：一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：芦笋花药的获取、芦笋花药的预处理、芦笋花药愈伤组织诱导、芦笋花药继代分化、试管苗生根、单倍体染色体加倍。以下是对上述技术方案的进一步改进：所述芦笋花药的获取，每年4-5月份采集芦笋不同单株的雄花花序，花序中花蕾长度为1-2mm，花粉为单核靠边期。所述芦笋，品种为冠军、鲁芦笋一号、格兰德或京绿1号。所述芦笋花药的预处理，将芦笋花蕾于3.5-4.5℃条件进行低温预处理2.5-3.5d。所述芦笋花药愈伤组织诱导，诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.25mg/LNAA，蔗糖浓度为5.0%，琼脂为0.7%，pH为5.8。所述芦笋花药愈伤组织诱导，于（26±1）℃的黑暗条件下进行暗培养2周，然后在（26±1）℃、光照强度在1000lx、光照时间16h/d的条件下培养20d后，开始出现愈伤组织。所述芦笋花药继代分化，分化成芽培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，培养基中蔗糖的浓度为4.0%、琼脂为0.7%、pH5.8。所述芦笋花药继代分化，在26±1℃，光照强度为2000lx，光照时间16h/d的条件下培养30d。所述试管苗生根，生根培养基为：MS+2.0mg/LNAA+1.0mg/LIBA+0.01mg/LKT，培养基中含蔗糖3.5%、琼脂0.5%，pH5.8，培养条件为25-28℃，每天光照16h。所述单倍体染色体加倍，利用秋水仙素处理芦笋单倍体试管苗，基本培养基为MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3.0%，琼脂0.7%，pH5.8，培养基中添加秋水仙素浓度为0.05mg/L，培养15d后，接转培养于不加秋水仙素的基本培养基上进行培养15d。由于采用了上述技术方案，本专利技术达到的技术效果是：（1）本专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，芦笋花药的质地坚硬紧密的愈伤组织的诱导率为7.2-17%；特别是品种‘冠军’的质地坚硬紧密的愈伤组织诱导率为15.8-17%以上。（2）本专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，单倍体分化率为2.2-7.2%，由单倍体诱导得到纯合二倍体和多倍体的成功率为45.86-49.73%，其中纯合二倍体占比为1.6-2.9%。（3）本专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，出芽率为113.2-125.4%，增殖系数为2.5-4.9。（4）本专利技术所述利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，花药培养试管苗的有效生根率为65.2-72.3%。（5）本专利技术所述方法，利用二倍体芦笋花药培养，筛选出单倍体植株，经染色体加倍后获得纯合二倍体种质，这种方法一代就可纯合，与常规育种相比缩短3-5年。本专利技术结合目前芦笋育种存在的上述实际问题，主要采用对优良雄株进行花药培养，获取优良芦笋单倍体；然后利用秋水仙碱在室内组培条件下进行染色体加倍，获得优良纯合芦笋种质资源；最后通过分子标记和镜检技术对获得的种质资源进行性别及倍性的鉴定，从而最终获得优良纯合二倍体雌株（mm），二倍体雄株（MM，以下称为“超雄株”）等种质资源。（6）本专利技术培育出的芦笋新品种出笋期、笋的直径、包头紧密度、植株高度等性状稳定、一致。（7）本专利技术培育出的芦笋，产量达到1800公斤/亩以上，提高20%左右，对推进我国芦笋生产的稳步发展具有重要意义。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法主要方案如下：1、芦笋花药培养步骤1.1芦笋花药的获取每年4-5月份上午8:00-10:00从田间取得20株不同单株的雄花花序，分别进行标记，芦笋雄株花序取回后选择长度为1-2mm左右的花蕾，镜检表明，此时花粉为单核靠边期。所述芦笋植株品种为‘冠军’。1.2芦笋花药的预处理将芦笋花蕾放在4℃冰箱进行低温预处理2.5-3.5d，在超净工作台上将花蕾先用75%酒精溶液浸泡10s，用无菌水冲洗3次，0.2%的升汞溶浸泡15min，用无菌水冲洗6-7次。1.3芦笋花药愈伤组织诱导在超净工作台上剥取花药接种于诱导培养基，花药愈伤组织诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.25mg/LNAA，蔗糖浓度为5.0%，琼脂为0.7%，pH为5.8。每瓶接种外观未破损的花药30枚，接种后培养瓶置于（26±1）℃的黑暗条件下进行暗培养2周，然后在（26±1）℃、光照强度在1000lx、光照时间16h/d的条件下培养20d后，开始出现愈伤组织，愈伤组织有两种形态，一种为质地坚硬紧密的愈伤组织，另一种为黄色的、疏松的、棉絮状愈伤组织；后续操作采用的是质地坚硬紧密的愈伤组织，所述质地坚硬紧密的愈伤组织的诱导率为15.8%。1.4芦笋花药继代分化由愈伤组织分化的芽接种在分化成芽培养基上进行分化，在（26±1）℃，光照强度为2000lx，光照时间16h/d的条件下培养，30d后测定出芽率、增殖系数和生长状态。所述分化成芽培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，培养基中蔗糖的浓度为4.0%、琼脂为0.7%、pH5.8。所述出芽率为125.4%，增殖系数为4.9，芽体粗壮，生长正常。1.5花药培养试管苗生根以继代增殖培养形成的正常嫩芽茎尖作为生根材料，生根培养基以MS为基本培养基，蔗糖3.5%、琼脂0.5%，pH5.8，添加不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：芦笋花药的获取、芦笋花药的预处理、芦笋花药愈伤组织诱导、芦笋花药继代分化、试管苗生根、单倍体染色体加倍。

【技术特征摘要】
1.一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：包括以下步骤：芦笋花药的获取、芦笋花药的预处理、芦笋花药愈伤组织诱导、芦笋花药继代分化、试管苗生根、单倍体染色体加倍。2.根据权利要求1所述的一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：所述芦笋花药的获取，每年4-5月份采集芦笋不同单株的雄花花序，花序中花蕾长度为1-2mm，花粉为单核靠边期。3.根据权利要求1所述的一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：所述芦笋，品种为冠军、鲁芦笋一号、格兰德或京绿1号。4.根据权利要求1所述的一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：所述芦笋花药的预处理，将芦笋花蕾于3.5-4.5℃条件进行低温预处理2.5-3.5d。5.根据权利要求1所述的一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：所述芦笋花药愈伤组织诱导，诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.25mg/LNAA，蔗糖浓度为5.0%，琼脂为0.7%，pH为5.8。6.根据权利要求5所述的一种利用花药培养获得芦笋纯合二倍体的方法，其特征在于：所述芦笋花药愈伤组织诱导，于（26±1）℃的黑暗条件下进行暗培养2周，然后在（26±1）℃、光照强度在1000lx、光照...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，李保华，包艳存，杨林，牟萌，牛晓雪，
申请(专利权)人：山东省潍坊市农业科学院，
类型：发明
国别省市：山东,37