鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及其鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列由上游引物：５′－ＣＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧ－３′，下游引物：５′－ＡＴＡＣＡＴＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴ－３′组成，使用该引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤：（１）提取黄瓜基因组的ＤＮＡ；（２）进行ＰＣＲ扩增；（３）ＰＣＲ扩增产物的凝胶电泳分析；（４）依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性，采用本方法的鉴定结果与田间抗病吻合率达９４％，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜白粉病抗性筛选上具有很大的应用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术中的DNA引物序列及其利用DNA引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法。
技术介绍
黄瓜白粉病(powdery mildew，Sphaerotheca fuliginea L.)是一种广泛发生的世界性植物病害。该病靠气流进行传播，喜温湿、耐干燥。在温度和湿度适宜的条件下，其病原体孢子萌发，病害先出现在植物下部叶片正面或背面，表现为白色小粉点，后扩大为粉状圆形斑。在条件适宜时，白色粉状斑点继续扩展，连接成片，成为边缘不明显的大片白粉区，直到布满整个叶片，看上去像长了一层白毛，所以俗称“白毛病”，患有白粉病的叶片逐渐变黄、发脆，白毛由白色转变为灰白色，最后使叶片失去光合作用功能。白粉病在黄瓜整个生长期均能发生，严重危害叶片，进而影响植株生长、结瓜，造成黄瓜减产，给蔬菜生产企业带来经济损失。我国十分重视黄瓜的抗病育种研究。从上个世纪50年代末，育种家就通过常规杂交、自交等育种方法进行黄瓜抗白粉病和抗霜霉病等的选育工作，并取得了显著成就，先后育成了一批优良品种，在生产上发挥了很大的作用。常规的抗病育种方法虽然发挥了很大作用，但也存在许多缺点。常规抗病品种的选育主要是通过杂交和多代自交，抗病材料的选择和田间鉴定过程复杂，周期相对较长，而且可靠性差。并大量地消耗人力、物力、财力及地力，加之黄瓜白粉病的病原(Sphaerothecafuliginea(Schlecht)Poll.)——单丝壳白粉菌(属子囊菌亚门真菌)——为专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，使得黄瓜白粉病的发生受季节限制，在非发病季节对该病的田间鉴定工作则难以进行。RFLP、RAPD等分子标记技术的问世，为育种提供了一条新的途径。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。分子标记技术在寻找与目标性状连锁的分子标记方面已有诸多报道，但与黄瓜白粉病抗性相关基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。在利用分子标记进行抗性鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列；本专利技术的另一个目的是用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法。本专利技术的技术方案概述如下鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列，它由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′组成。一种使用上述引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组的DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析将扩增产物采用6％变性聚丙烯胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。第二种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列，它包括两组引物，所述第一组引物由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′组成，所述第二组引物由上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′组成。一种使用第二种引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组的DNA；(2)进行PCR扩增在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入所述黄瓜基因组DNA 15～30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入第一组上游引物5′-CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20～40ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入第二组上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在两支扩增专用薄壁管中分别加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μ，将所述两支PCR扩增专用薄壁管分别进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，第一支PCR扩增专用薄壁管在50～55℃退火40～60秒，第二支PCR扩增专用薄壁管在53～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸5～7分钟，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将两个扩增产物均采用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先制备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。该技术鉴定结果与田间抗病吻合率达94％，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜白粉病抗性筛选上具有很大的应用价值。附图说明图1是第一种技术方案的电泳图；图2和图3是第二种技术方案的电泳图。具体实施例方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明实施例1一种使用鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列鉴定黄瓜白粉病抗性的方法，包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组的DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入黄瓜基因组DNA 30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′30ng、dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性300秒，94℃变性60秒，48℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析将扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列，其特征在于它由上游引物：５′－ＣＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧ－３′，下游引物：５′－ＡＴＡＣＡＴＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＡＡＴ－３′组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜胜利，张桂华，李淑菊，魏爱民，张历，韩毅科，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，天津市农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]