用于生成数字荧光图像的方法技术

在用于建立数字荧光图像的方法中，将针对每个像素从物平面的发射光转换成分别配属于测量时间点的振幅(I)的序列，并且振幅(I)的序列以彼此错开了至少一个时间偏差(τ)的方式自相关，并且针对其中每个时间偏差(τ)形成特定的相关振幅(Kτ)，由该相关振幅(Kτ)求出总振幅。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生成数字荧光图像的方法
本专利技术涉及一种用来由配设有荧光染料的样本生成数字荧光图像(电子图像文件)的方法。
技术介绍
荧光显微术是一种用于对蛋白质定位并且绘制组织样本和细胞(下文为样本)内的蛋白质分布的极为有效的光学显微术方法。为此有针对性地将荧光染料输送给有待用显微镜检验的样本，荧光染料与蛋白质对接。通过以依赖于所使用的染料的确定的波长(激发波长)的光(激发光)进行照射来激发这种染料，并且将染料分子(荧光团)的电子提升到更高的能量水平。在短暂的停留时间之后，被激发的电子分别在发射有比激发波长更长的特定波长(发射波长)的光(发射光)的情况下再次达到其最初的水平。单个电子在此发出光量子或光子。这种特性用于使蛋白质或其它物质变得可见。除了被用于可视地观察样本，荧光显微镜被划分成传统的宽场显微镜和激光扫描显微镜，宽场显微镜带有相机，该相机包括多个以矩阵布置的探测器，激光扫描显微镜仅具有单独的探测器。两种类型的显微镜目前都常见，其中，激光扫描显微镜相比传统的宽场荧光显微镜具有许多优势。激光扫描显微镜通常是共焦的显微镜，这就是说，激发光的处在物平面中的焦点被成像到共轭的平面中，亦即像平面中，通常带有前置的孔眼光阑的单独的探测器定位在那里。因此仅微小的物场截面的，亦即微小的像素的发射光被导引到探测器上。这相比传统的宽场荧光显微镜具有重要的优势，即，仅探测发射光的来自焦点平面的光量子并且有助于信号形成。以这种方式可以一层一层地用显微镜检测样本并且将由每个用显微镜检测到的层的信号产生的荧光图像聚成三维的图像。通过如下方式获得每一层的荧光图像，即，通过通常由两个振镜构成的激光扫描系统以一个扫描频率扫描物场，从该扫描频率得出了针对每个像素的像素停留时间。在像素停留时间期间被探测器接收到的发射光通过这个探测器转换成模拟的电探测器信号，模拟的电探测器信号通过获知激光扫描系统的各自的位置而分别配属于一个像素。模拟的探测器信号首先以预定的节拍频率被数字化。为此，在激光扫描显微术领域内原则上公知两种类型的数字化。第一种类型的数字化是对模拟的探测器信号进行积分。当信号探测的持续时间(探测时间)处于和像素停留时间相同的数量级时，也就是说探测时间仅比像素停留时间稍短时，就使用第一种类型的数字化。由在此通过模拟信号形成的积分值和探测时间可以利用对探测器进行一次读取推导出每个像素的平均值(平均值振幅)，该平均值是配属于该像素的总振幅。在过去，基于荧光染料的仅很小的辐射强度，尤其使用积分这种方法，因为可以形成较高的总振幅。第二种类型的数字化是对模拟的探测器信号进行快速的扫描(取样)。当探测时间明显较短，特别是比像素停留时间短了若干数量级时，优选使用第二种类型的数字化。然后在像素停留时间内在多个测量时间点上(信号探测的持续时间被简化地视作时间点，或者测量时间点是读取探测器的时间点)分别产生振幅，并且由振幅序列形成了平均值(平均值振幅)，该平均值作为总振幅分别配属于像素。这种快速的扫描当前在激光扫描显微术中是常见的，因为在使用现代模数转换器时该方法的优点占优势。典型地转换具有恒定的采样率的探测器信号，该恒定的采样率明显比最短的可能的像素停留时间高了优选至少一个数量级，尤其两个数量级。每个像素的测量时间点的数量然后由像素停留时间得出。这又通过扫描设定(帧率、像素数、扫描尺寸)来确定。像素停留时间的提高然后导致了每个像素的测量时间点的数量的提高。为了改善信噪比，通常提高像素停留时间。缺陷在于，用于获得呈网格图形的形式的由所有像素的总振幅形成的荧光图像的总时间因此提高且帧率减小。信噪比由一方面由发射光导致且另一方面由噪音导致的份额占总振幅的比例确定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提出一种方法，其在保持帧率的情况下提供了具有改良的信噪比的数字荧光图像。这个技术问题通过一种用于建立数字荧光图像的方法来解决，在该方法中，配设有荧光染料的样品被布置在激光扫描显微镜的物平面中并且在时间上依次以逐个像素的方式(pixelweise)在像素停留时间期间用激发光加载，因此针对每个像素产生发射光。每个像素的发射光由探测器探测并且被转换成分别配属于测量时间点的振幅序列。由振幅分别形成针对每个像素的总振幅。所有像素的总振幅被组合成荧光图像。对本专利技术而言重要的是，分别配属于像素的总振幅由一个或多个相关振幅求出并且因此噪声几乎不算入总振幅，因而产生了具有更高的信噪比的荧光图像。为此，将在较晚的测量时间点上开始的振幅的序列与在较早的测量时间点上开始的振幅的同样序列进行至少一次相关。在此，较晚的测量时间点和较早的测量时间点彼此具有时间偏差。这就是说，取代有时间偏差的仅一次自相关，可以使振幅序列进行多次自相关，其中，针对每一次自相关使用另一个时间偏差。针对每个时间偏差就形成了针对各个时间偏差特定的相关振幅且总振幅由所形成的相关振幅求出。能相关的振幅对的数量对应每一像素停留时间的所有测量时间点的数量减去时间偏差。优选用下列公式计算相关振幅：Kτ＝((I(tn)-I平均)×(I(tm)-I平均))平均在此，I(tn)是较早的测量时间点tn的振幅，I(tm)是较晚的测量时间点tm的振幅，m＝n+τ，并且I平均是平均振幅，它作为所有振幅的平均值计算。有利的是，将相关振幅Kτ通过与平均值振幅的平方I平均2相除来进行标准化。当计算出针对不同的时间偏差τ的相关振幅Kτ并且确定具有相对最大的相关振幅Kτ的时间偏差τ，并且将其用作总振幅时，可以改善荧光图像的质量。配属于相对最大的相关振幅Kτ的时间偏差τ可以有利地以配属于荧光染料的方式储存在数据库中。作为备选，计算出针对不同时间偏差τ的相关振幅Kτ并且确定相关振幅Kτ的平均值，并且将该平均值用作总振幅。也可以计算处针对不同时间偏差τ的相关振幅Kτ并且确定相关振幅Kτ的和，并且将该和用作总振幅。测量时间点的数量有利地大于400，并且时间偏差τ位于50与150之间，因而至少250个振幅对被相关。按本专利技术的方法利用的是，荧光染料在发出发射光时由至少一个相关的过程决定，这就是说，表示发射光在像素停留时间的持续时间内的强度的荧光信号由至少一个函数所决定。在此，公知作为相关的过程的例如有光闪烁和光漂白。人们将光闪烁理解与黑暗状态交替地在确定的时段发射光子。发荧光的材料荧光物质的通过激发光射出的电子，被提升到较高的能量水平并且在返回到能量较低的水平时发射光子。但这一点不是连续地发生，而是在此期间存在若干阶段，亦即所谓的黑暗状态，在黑暗状态中不发射任何光子。这种黑暗状态可以例如涉及所谓的三重状态或另一种状态，从该状态出来不能发生荧光发射。如果在观察荧光团时力求使探测时间这样小，从而在探测时间内仅一个光子撞击到接收器上，那么这导致了对此而言典型的给光-撤光现象(An-Aus-Erscheinung)。这种现象的时标和它的准确起因是多种多样的并且也不是非常详尽公知的。当假设荧光团表现为静止，也就是说，它们在一个像素内的数量至少在像素停留时间内保持不变时，那么可以在较小的停留时间下基于闪烁而探测循环的强度波动。光漂白理解为是荧光团不可逆地过渡到不发荧光的状态。对此，时标和起因也是多种多样的且无法极为详尽公知。公知的是光漂白与激发光的强度的相关性。尤本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生成数字荧光图像的方法，其中，将配设有荧光物质的样本布置在激光扫描显微镜的物平面中，并且在时间上依次以逐个像素的方式在像素停留时间(T)期间用激发光加载所述样本，由此针对每个像素产生发射光，通过探测器探测所述发射光并且将所述发射光转换成分别配属于测量时间点的振幅(I)的序列，由这些分别配属于测量时间点的振幅形成总振幅，并且将所有像素的总振幅组合成荧光图像，其特征在于，将在较晚的测量时间点(tm)开始的振幅(I)的序列与在相对于所述较晚的测量时间点(tm)具有时间偏差(τ)的较早的测量时间点(tn)开始的振幅(I)的同样序列进行至少一次自相关，分别形成针对其中一个时间偏差(τ)特定的相关振幅(Kτ)并且由所形成的所述至少一个相关振幅(Kτ)求出总振幅。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.31 DE 102015112628.11.用于生成数字荧光图像的方法，其中，将配设有荧光物质的样本布置在激光扫描显微镜的物平面中，并且在时间上依次以逐个像素的方式在像素停留时间(T)期间用激发光加载所述样本，由此针对每个像素产生发射光，通过探测器探测所述发射光并且将所述发射光转换成分别配属于测量时间点的振幅(I)的序列，由这些分别配属于测量时间点的振幅形成总振幅，并且将所有像素的总振幅组合成荧光图像，其特征在于，将在较晚的测量时间点(tm)开始的振幅(I)的序列与在相对于所述较晚的测量时间点(tm)具有时间偏差(τ)的较早的测量时间点(tn)开始的振幅(I)的同样序列进行至少一次自相关，分别形成针对其中一个时间偏差(τ)特定的相关振幅(Kτ)并且由所形成的所述至少一个相关振幅(Kτ)求出总振幅。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，利用公式Kτ＝((I(tn)-I平均)×(I(tm)-I平均))平均计算出相关振幅(Kτ)，其中，I(tn)是较早的测量时间点(tn...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·卡尔克布伦纳，拉尔夫·沃勒申斯基，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE