重组人尿激酶原氨基末端片段的制备、活性测定方法及其在疾病治疗中的应用技术

技术编号:1755986 阅读:216 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种抑制尿激酶原(proUK)/尿激酶原受体(uPAR)相互作用的重组蛋白的制备方法和活性鉴定。由于uPA/uPAR在许多病理生理过程中发挥了重要的作用,阻断这一通路将会对疾病的发生和发展起到阻滞作用。本发明专利技术中制备的人尿激酶原氨基末端片段(ATF)通过体外活性鉴定表明其能够抑制尿激酶原与位于细胞表面的尿激酶原受体的结合。同时也能抑制尿激酶(UK)对纤溶酶原(plasminogen)以及纤溶酶(plasmin)对proUK的激活。这预示着rhATF可能在抑制uPA/uPAR参与的病理生理过程中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用基因工程方法生产一种能够抑制proUK/UK与uPAR相互作用的蛋白片段以及在疾病治疗中的应用。
技术介绍
细胞迁移是细胞黏附和去黏附的周期性过程。在生物体的生长发育、组织形成、分化、炎症反应、创伤修复、动脉粥样硬化、肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的侵袭等多种生理、病理过程中均会有细胞迁移。近年来的一些研究表明uPA/uPAR在细胞迁移过程中发挥了很重要的作用。uPAR介导的细胞表面蛋白裂解和非蛋白裂解是细胞迁移和趋化的中枢。uPA与uPAR的结合诱导uPAR与玻蛋白结合,调节uPAR与整合素之间的相互作用或促进胞内信号传导级联,促进前导区黏附,从而刺激细胞迁移;同时在细胞尾部,uPA促进纤溶酶原转化生成纤溶酶,促进迁移细胞尾部细胞外基质和细胞黏附分子的降解,导致细胞尾部的回缩。在大部分发生黏附和迁移的上皮细胞和肿瘤细胞中,uPA可以通过与β1β3整合素连同富含小窝蛋白或激酶的细胞膜区域各种蛋白分子相互作用,来调控整合素的黏附特性及其信号传导能力。uPAR在迁移细胞的引导表面呈局限性分布,从而通过结合uPA促进纤溶酶原向纤溶酶的转化。纤溶酶是一种能够直接降解纤粘连蛋白,层粘连蛋白和玻粘连蛋白等细胞外基质成分的丝氨酸蛋白水解酶。同时,纤溶酶通过水解基质金属蛋白水解酶原使之变成有活力的基质金属蛋白水解酶,可以起到间接降解细胞外基质的目的。从而为细胞迁移扫除障碍。人源性uPA是一个分子量为54kD的蛋白质,从N端到C端分别是表皮生长因子结构域(EGF domain)、环柄结构域(kringle domain)和丝氨酸蛋白酶结构域。其中环柄结构域和kringle结构域并在一起称为尿激酶的氨基末端片段(amino-terminal fragment,ATF)。近年来的一些研究表明,uPA是通过其ATF结构域与uPAR结合的。这种结合与丝氨酸蛋白水解酶结构域无关。ATF所包含的表皮生长因子结构域参与了和尿激酶受体的结合,并诱导细胞的黏附和迁移作用;而ATF的环柄结构域则具有化学趋化活性以及抑制肿瘤血管内皮细胞生长的功能。ATF通过阻断uPA和uPAR的相互作用,可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。大量研究表明,肿瘤细胞表面的uPAR表达量显著高于正常细胞,且高表达uPA、uPAR的肿瘤病人其愈后差、生存期短。由于uPA、uPAR系统在肿瘤侵袭转移中的重要作用,普遍认为uPA、uPAR是抗肿瘤侵袭、转移的重要靶标。通过干扰uPA、uPAR的相互作用和抑制uPA活性来抑制肿瘤细胞侵袭转移,成为抗肿瘤侵袭转移治疗的一种新思路。由于ATF和uPAR之间的结合特异性和亲和性(Kd=4×10-10mol/L),目前有人将ATF与生物毒素偶联,定向灭活肿瘤细胞,因此ATF作为一种潜在的肿瘤治疗药物受到关注。最近Wada M及Alfano M等发现,ATF可抑制HIV病毒的复制和病毒粒子的释放,从而为艾滋病的治疗提供了一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种重组人尿激酶原氨基末端片段的制备、活性测定方法及其在疾病治疗中的应用,本专利技术提供了一种制备蛋白的方法,并对其活性做了测定,发现其可以抑制proUK和uPAR的结合。本专利技术的技术解决方案一种重组人尿激酶原氨基末端片段的制备方法,其特征为表达质粒的构建,阳性克隆的筛选,重组人尿激酶原氨基末端片段的诱导表达及纯化。一种测定重组人尿激酶原氨基末端片段活性测定的方法,其特征为重组人尿激酶原氨基末端片段与经过处理的U937细胞和proUK保温后,用zymograph法测定细胞表面解离的proUK含量从而推测重组人尿激酶原氨基末端片段活性的方法。一种测定重组人尿激酶原氨基末端片段的方法,其特征为用酶动力学方法测定重组人尿激酶原氨基末端片段对UK激活纤溶酶原(plasminogen)和纤溶酶(plasmin)激活proUK的影响。本专利技术所生产的ATF在抑制HIV病毒的复制和病毒粒子释放方面的作用及在治疗艾滋病方面的应用。本专利技术所生产的ATF在抑制内皮细胞增殖和迁移方面的作用和在抑制肿瘤细胞生长和迁移方面的作用。本专利技术所生产的ATF用来和一些生物毒素或药物耦联来定向灭活肿瘤细胞方面的作用。本专利技术所生产的ATF用来抑制proUK或UK参与的酶促反应方面的应用。本专利技术提供了一种通过基因工程方法制备重组人尿激酶原氨基末端片段的方法,并且在一实施例中通过这种方法生产的重组人尿激酶原能够抑制细胞表面的尿激酶受体和尿激酶原的结合。在另一实施例中,重组人尿激酶原氨基末端片段能够抑制尿激酶对纤溶酶原的激活和纤溶酶对尿激酶原的激活。其中人尿激酶原氨基末端片段是人尿激酶的第1个残基到第135个残基之间的部分。广义上,任何细胞只要表面有尿激酶受体的,均可用来在实施例中进行投送,而不仅限于下文列举的实施例。另一实施例中,通过酶动力学方法测定ATF活力的方法不仅仅限于那两种反应。只要酶促反应过程中有尿激酶或尿激酶原参与的反应均可用来测定其活力。本专利技术方法是后续应用研究的前奏,为后续研究提供一种有活力的药用蛋白。后续研究是指凡是有uPA和uPAR参与的病理生理过程均可用本专利技术生产出来的ATF进行阻断研究。如,肿瘤的生长和侵袭过程,肿瘤血管生成,伤口愈合等。附图说明图1为重组表达质粒pET-29a(+)/ATF的构建流程图。图2为重组质粒pET-29a(+)/ATF的酶切鉴定图谱。其中,第一泳道(Lane1)为DNA分子量标准,第二泳道(Lane2)为PCR产物条带,第三泳道(Lane3)为XhoI和NdeI双酶切产物。图3为rhATF IPTG诱导表达图谱。图4为rhATF CM-cellulose离子交换层析图谱,即复性后样品对醋酸溶液透析后上CM-cellulose柱后洗脱图谱。图5为rhATF的分子筛层析图谱,即rhATF样品进一步上Superdex G-75凝胶过滤柱后的分子筛层析图谱。图6为rhATF的SDS-PAGE电泳图谱,最终纯化得到的rhATF样品电泳图谱。其中,第一泳道为中分子量蛋白标准,第二泳道为经CM-cellulose柱纯化后的样品,第三泳道为经Superdex G-75分子筛层析纯化后的样品。图7为rhATF对proUK与uPAR结合作用的影响图谱。zymograph测定并比较从细胞表面解离的proUK。其中,第一泳道为ATF与proUK一起与细胞保温处理的,第二泳道仅是细胞培养液,第三泳道仅是proUK与细胞保温处理的。图8为rhATF对UK激活plasminogen的影响曲线图。图9为rhATF对Lys-plasmin激活proUK的影响曲线图。具体实施例方式本专利技术提供了一种制备重组人尿激酶原氨基末端片段的方法。首先提取人脐带静脉内皮细胞总RNA,经RT-PCR扩增出人尿激酶原氨基末端片段基因,双酶切后与载体耦联。转化鉴定阳性克隆并测序后用大肠杆菌BL21(DE3)表达出重组人尿激酶原氨基末端片段。之后对其活力进行了测定。发现通过该方法生产的重组人尿激酶原氨基末端片段能够抑制尿激酶原与其细胞表面受体的结合,以及能够抑制纤溶酶对尿激酶原的激活和尿激酶对纤溶酶原的激活。具体实施例方式1.1材料1.1.1菌株和质粒 人脐带静脉内皮细胞株(HUVEC)购自Clonetic本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种重组人尿激酶原氨基末端片段的制备方法,其特征为表达质粒的构建,阳性克隆的筛选,重组人尿激酶原氨基末端片段的诱导表达及纯化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员:刘建宁陈新园孙自勇朱镇华
申请(专利权)人:南京大学生物制药工程研究中心
类型:发明
国别省市:84[中国|南京]

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