转录水平沉默的植物基因制造技术

本发明专利技术涉及转基因整合到植物基因组中后所观察到的基因沉默。比较两种拟南芥属品系转录水平基因表达，其中一种以多拷贝的形式带有沉默的转基因，另一种则是其突变体衍生物ｍｏｍｌ，它在使该转基因处于沉默上受到损害。经比较发现有两个ｃＤＮＡ克隆在突变的植株中表达，而在其亲本和野生型植株中都没有表达。这两个克隆都来自于同一个转录物家族，被称作ＴＳＩ（转录水平沉默信息）。编码ＴＳＩ的基因组模板在多种生态型中都是主要位于中心粒旁、组成保守的重复元件。在上述突变体中，ＴＳＩ基因组模板的转录水平沉默被特异的解除了。ＴＳＩ的转录可被用来作为鉴定植物中缺陷型沉默途径的标志。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本案为分案申请，母案申请号为00812946.0(国际申请号PCT/EP00/08994)，申请日2000年9月14日，专利技术名称“转录水平沉默的植物基因”。本专利技术涉及植物基因表达领域，尤其是关于基因沉默，这种植物基因组整合入转基因后经常观察到的现象。比较两种拟南芥属品系的转录基因表达，其中一种以多拷贝的形式带有一种沉默的转基因，另一种则是其突变体衍生物mom1，它在使该转基因沉默方面受到损害。比较发现有两个cDNA克隆在突变的植株中进行表达，而在其亲本和野生型植株中都没有表达。这两个克隆都来自于同一个转录物家族，被称作TSI(转录水平沉默信息，Transcriptionally Silent Information)。已公开的编码TSI的基因组模板在多种生态型中都是主要位于中心粒附近，并且组织保守的重复元件。它们也被称作TSI。在上述突变体中，基因组TSI模板的转录水平沉默被特异的解除了。该模板的沉默还在已知影响基因转录水平沉默的其它基因型中进一步解除了。因此，TSI的转录可被用来作为鉴定植物中缺陷型沉默途径的标志。对于任何活细胞而言，遗传信息的活化和沉默之间正确的平衡是至关重要的。基因表达的严谨型控制对于适应环境因素、调节生理需求、分化、特化细胞类型在多细胞有机体中的发育，都是必需的。例如，分化过程中涉及可通过有丝分裂遗传的基因表达的改变，其中基因活性所处的状态具有一定的稳定性。这种稳定性可能来自对基因活化子的严格控制，对转录物稳定性的调节，或者经稳定沉默选定而调控遗传信息自身的转录可利用性遗传位点。在许多实验体系中，基因沉默经常伴随着抑制转基因的表达而出现。在植物中，转基因座位的沉默限制了用转基因的方式来提高品质性状的可靠性。已引起注意的是，带有转基因多拷贝重排的复杂插入片段特别容易产生基因沉默。现已发现了两种使转基因不能表达的不同机制。一种阻止转录(称为转录水平基因沉默或者TGS)，另一种靶向选定的转录物使之迅速降解(称为转录后基因沉默或者PTGS)。两种过程的引发机制看起来相似，因为两种类型的沉默，其产生都与遗传信息的冗余相关，即与TGS相对应的是DNA重复片段，与PTGS相对应的是RNA的过量产生。TGS可减数分裂遗传，与DNA模板的修饰有关，表现为被沉默基因的启动子高度甲基化，或染色质结构的局部改变。相比之下，PTGS不能通过减数分裂传递，需要在每一个有性世代中进行重建。PTGS无需DNA模板的修饰，但是，在被沉默基因的蛋白质编码区也观察到了DNA甲基化水平的提高。在植物系统中，对基因沉默的研究主要涉及转基因的沉默。只有很少的一些关于基因沉默的例子不涉及转基因座位。遗传信息对TGS敏感性的标准还了解的非常少，并且正常野生型植物中转录水平沉默的天然目标也还未知。推测TGS是一种防御系统，用来抵御如转座因子这类的入侵DNA，但是这一假说还缺乏实验证据。在本专利技术文中，提及基因时被认为是指包含调控序列的DNA编码序列，该调控序列可以使编码序列转录为RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA。调节序列例如是启动子序列、5’和3’非翻译序列、内含子，以及终止序列。启动子被认为是用来起动与之相联的DNA转录的一段DNA序列，它可能还包括一些调节基因表达的元件，如活化子、增强子或者抑制子。基因的表达指的是基因在活细胞中转录成RNA，或者是转录并随后翻译为蛋白质。特异核苷酸或氨基酸序列的任何部分或片段都被认为是组分序列。本专利技术的目的是要提供编码遗传信息的核酸分子，它们在野生型植物中是不表达的，即沉默的，但是在转录水平基因沉默缺失的植物中能够表达。这些分子能用式RA-RB-RC限定，其中-RA、RB和RC代表由核苷酸残基组成的组分序列，这些残基独立地分别选自G、A、T、C组，或G、A、U、C组，其中G是鸟苷酸，A是腺苷酸，T是胸苷酸，U是尿苷酸，C是胞苷酸，-RA和RC分别由0～6000个核苷酸残基组成；-RB由至少50个核苷酸残基组成；并且-组分序列RB与以下比对组分序列之一至少有80％的同一性SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO27。在本专利技术的一个优选实施方案中，RB由至少100个核苷酸残基组成，与以下比对组分序列之一有至少85％的同一性SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO27。在另一个优选实施方案中，RB由至少200个核苷酸残基组成，与以下比对组分序列有至少90％的同一性SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO27。RB的具体例子是SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO27的序列。另外，RA或RC可能包含一个或多个组分序列，其长度至少为50个核苷酸残基，并与以下比对组分序列具有至少90％的同一性SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO27。根据本专利技术所述的核酸分子，可以是DNA或RNA。优选的实施方案是基因组DNA、cDNA、质粒DNA或由它们转录出的RNA。SEQ ID NO1第437-2383位核苷酸被认为可能是一编码648个氨基酸的开放阅读框(SEQ ID NO10)，其中被一跨越1631-1633的终止密码子所打断。本专利技术一个更为优选的实施方案是编码包含有至少200个氨基酸、并与SEQ ID NO10的比对组分序列有至少85％同一性的组分序列的蛋白质的核酸。根据本专利技术的核酸代表转录水平沉默系统的内源性目标。实施例1描述了本专利技术从拟南芥属中克隆具体实施方案。优选转录RNA的长度在1000～6000个核苷酸之间，特别是转录物为大约1250、2500、4700和5000个核苷酸，可以是被或未被多聚腺苷酸化。据发现，野生型植株基因组中存在的转录水平沉默信息，仅仅在某些转录水平沉默的维持受到影响的突变体中得到表达。重要的是，不仅因基因组范围内DNA甲基化水平的改变而影响了转录水平沉默的株系，而且甲基化水平维持不变、没有明显表型变化的沉默突变体均能激活TSI，这表明解除内源性模板的沉默并不需要去甲基化。最初克隆了两个代表只在沉默突变体中才被特异表达的RNA的独立克隆。预测在野生型植株中，可能有更多的DNA模板被沉默系统所抑制，值得注意的是，在这两个克隆所得到的cDNA中，有些部分彼此紧密相关，很有可能它们是同一转录物的部分。三个主要的TSI转录物，分别具有5000、2500以及1250个核苷酸。它们都含有一中间元件，称为TSI-A(SEQID N本文档来自技高网...

【技术保护点】
选择相比于野生型植物而言其转录水平基因沉默受损的植物的方法，该方法包括：（ａ）分别制备一系列植物的ＲＮＡ；（ｂ）用核酸探测这些ＲＮＡ制品，该核酸由至少５０个核苷酸残基的序列组成，所述序列与选自以下的序列比对时具有至少８０％的 同一性：ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱ　 　ＩＤＮＯ：９或ＳＥＱＩＤＮＯ：２７；并且（ｃ）鉴定其ＲＮＡ与所述核酸杂交的植物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A斯泰默，O米特尔斯坦谢德，J帕兹科斯基，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]