一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，其主要步骤包括：(1)钛片的预处理，(2)制备生物素化聚吡咯(Biotin‑Ppy)钛片，(3)制备生物素化的脂肪干细胞微泡(ASCs‑MV)，(4)将生物素标记的ASCs‑MV与生物素化聚吡咯钛片进行复合接种，制备得到所述负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片。ASCs‑MV具有良好的促进血管新生及促干细胞增殖性能，利用具有级联放大效应的亲和素‑生物素系统，ASCs‑MV可以成功对生物素化聚吡咯钛片进行表面修饰，有效提高成骨细胞的成骨与成血管能力，为骨再生提供一种有潜力的材料改性方法。

Preparation and application of a biotinylated titanium tablet loaded with fat stem cell microbubbles

The invention provides a load of adipose derived stem cells biotinylated microbubbles preparation method of titanium sheet, which comprises the following steps: (1) the pretreatment of the titanium plate, (2) the preparation of biotinylated polypyrrole (Biotin Ppy) titanium sheet (3) preparation of microbubble fat biotin the stem cells (ASCs MV), (4) ASCs MV and biological biotinylated polypyrrole composite films of titanium were prepared, the load of adipose derived stem cells microbubble biotinylated titanium. ASCs MV can promote angiogenesis and promote stem cell proliferation performance, avidin biotin system has cascade amplification using ASCs MV can be modified to biotinylated polypyrrole titanium plate, effectively improve the osteoblast osteogenesis and angiogenesis ability, provide a modified method a potential material for bone regeneration.

【技术实现步骤摘要】
一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物材料应用领域，具体是一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法及其应用。
技术介绍
钛合金具有良好的组织相容性、足够的强度、易于塑形的弹性模量、较强的耐腐蚀性、对CT与MRI成像无干扰、X线投射性好等优势，近30年来临床应用极为广泛，如颌面外科接骨固定板、牙科种植体、人工骨关节等，是目前最为理想的金属骨植入材料。骨植入物种植成功的关键在于“在种植体与骨之间形成良好的结构与功能连接”，即骨整合。虽然钛及其合金应用广泛，但由于钛表面存在惰性氧化层，限制了其与骨组织间形成理想的化学结合，从而导致植入体内后与组织之间形成一层非矿化层，易发生松动和脱落，骨整合性欠佳。种植体植入机体后，与骨的骨性结合是关系到种植体在体内维持时间长短的关键。如何使钛合金植入机体后与骨形成骨性结合是钛合金种植体的研究热点与重点。对钛材料的表面进行改性后能有效提高生物相容性。大量研究表明，粗糙的形貌能促进细胞的黏附、增殖与成骨分化，并且可促进细胞外基质蛋白的沉积。除了表面拓扑形貌改性，利用生物分子修饰钛材料使其表面具备生物活性也是常用的改性方式。这些生物分子主要包括生长因子、多肽、核酸与细胞外基质成分等，它们能通过不同的机制提高钛材料的植入效果。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法及其应用，将生物素标记的脂肪干细胞微泡与生物素化后的钛片进行复合，有效提高成骨细胞的成骨与成血管能力。本专利技术提供的技术方案：一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，包括如下步骤：(1)钛片的预处理：将钛棒加工成方形钛片，金相砂纸打磨至1200目，依此用丙酮、乙醇、去离子水清洗5-10分钟后烘干备用；(2)制备生物素化聚吡咯钛片(Biotin-Ppy/Ti)：以步骤(1)所得的钛片为工作电极、铂片为对电极，饱和汞电极为参比电极，以含有吡咯和生物素的水溶液为电解液，进行三电极体系电化学反应，将制备好的生物素化聚吡咯钛片用环氧乙烷消毒后，在10-20μg/mL的链霉亲和素中4℃孵育过夜，再采用PBS(磷酸盐缓冲液)于4℃保存备用；(3)制备脂肪干细胞微泡(ASCs-MV)：选取自培养至第3代到第5代的脂肪干细胞(ASCs)，经过多次超速离心后，弃上清，将超离管倒扣至无菌纱布上，沥干，采用PBS重悬沉淀后，得到ASCs-MV溶液，在100000g×1h下，4℃超速离心得到所需要的ASCs-MV沉淀；(4)制备生物素化的脂肪干细胞微泡：取一定质量的磷脂聚乙二醇生物素(DSPE-PEG-Biotin)溶解到无水乙醇溶液中，并搅拌使其充分溶解，配置成浓度为1mmol/L的DSPE-PEG-Biotin溶液；向步骤(3)中所得的ASCs-MV沉淀依次滴加DiluentC稀释剂溶液和DSPE-PEG-Biotin溶液，然后在16000g×1h于4℃超速离心，PBS重悬沉淀得到生物素化的脂肪干细胞微泡；(5)取一定量的步骤(4)得到的生物素化的脂肪干细胞微泡悬液滴加到步骤(2)制备好的生物素化聚吡咯钛片上，室温下孵育1-3小时，得到所述负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片。进一步的，所述步骤(2)中的电解液的制备方法是：将81.7mg十二烷基苯磺酸钠(NaDBS)、201.3mg吡咯(Py)与7.3mg生物素(Biotin)加入到30mL去离子水中搅拌均匀溶解后得到。进一步的，所述步骤(3)的具体操作步骤为：①收集P3-P5代脂肪干细胞的上清，4℃离心300g×10min，弃底部沉淀，将上清转移至超离管中；②将步骤①中的上清依次经2000g×10min、10000g×30min于4℃下超速离心，每次离心后弃掉底部沉淀；③将步骤②中最终所得上清依此经100000g×2h、100000g×1h于4℃下超速离心，每次离心后弃掉上清；④弃掉步骤③最终所得上清，将超离管倒扣至无菌纱布上，沥干2min，100μLPBS重悬，测定蛋白浓度后，吸取蛋白含量为40μg的脂肪干细胞微泡溶液，在100000g×1h下于4℃超速离心得到所需要的脂肪干细胞微泡沉淀。进一步的，步骤(1)中所述钛棒为TC4钛棒，所述方形钛片的边长为5mm、厚度为1mm。进一步的，所述步骤(2)中三电极体系电化学反应采用恒电位模式，调节电压为0.9V或1.5V，反应时间为5min。进一步的，所述步骤(2)中采用环氧乙烷消毒时的温度为37℃。进一步的，所述步骤(4)中向脂肪干细胞微泡沉淀依次滴加的DiluentC溶液的体积为1mL，磷脂聚乙二醇生物素溶液的体积为10μL。进一步的，所述步骤(5)中滴加的生物素化的脂肪干细胞微泡悬液的体积为300-500μL。所述负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片用作金属骨植入材料。本专利技术中脂肪干细胞从人体脂肪组织中分离，再进行细胞培养后得到，采用的分离和培养方法为现有技术中公开的方法，本专利技术中采用的其他生化试剂及原料均通过购买得到。本专利技术的有益效果：ASCs-MV具有良好的促进血管新生及促干细胞增殖性能，利用具有级联放大效应的亲和素-生物素系统，ASCs-MV可以成功对生物素化聚吡咯钛片进行表面修饰，相对于普通钛片和生物素化钛片，对成骨分化相关基因如碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(COL1)和成血管基因如血管内皮生长因子(VEGF),表皮细胞生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)等的表达显著增加，能有效提高成骨细胞的成骨与成血管能力，为骨再生提供一种有潜力的材料改性方法。附图说明图1是本专利技术制备得到的生物素化聚吡咯钛片；图2是脂肪干细胞微泡与纯钛片负载情况的荧光染色图；图3是脂肪干细胞微泡与生物素化聚吡咯钛片负载情况的荧光染色图；图4和图5分别表示脂肪干细胞微泡与生物素化聚吡咯钛片负载后第1天和第7天的荧光染色图；图6是图2和图3的微泡负载量的定量统计图；图7是图4和图5的微泡负载量的定量统计图；图8、9、10、11分别表示脂肪干细胞微泡修饰的生物素化钛(Bio-BVTi)对细胞成骨分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(COL1)、成骨转录因子(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)的表达情况的数据统计图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，具体包括以下步骤：(1)钛片的预处理将TC4钛棒加工成边长为5mm、厚度为1mm的方形钛片，金相砂纸打磨至1200目，依此用丙酮、乙醇、去离子水清洗10分钟后烘干备用。(2)制备生物素化聚吡咯(Biotin-Ppy)钛片①将81.7mgNaDBS、201.3mg吡咯(Py)与7.3mg生物素(Biotin)加入到30mL去离子水中搅拌均匀。②以钛片为工作电极、铂片为对电极，饱和汞电极为参比电极进行三电极体系电化学反应，选择恒电位模式，调节电压为1.5V，反应时间为5min，反应期间电解池中持续通入氮气。③将制备好的Biotin-Ppy/Ti用环氧乙烷(37℃)消毒后于10μg/mL的链霉亲和素中4℃孵育过夜，PBS4℃保存备用。(3)制备生物素化脂肪干细胞微泡①收集P3-P5代ASCs的上清，4℃离心300g×10min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)钛片的预处理：将钛棒加工成方形钛片，金相砂纸打磨至1200目，依此用丙酮、乙醇、去离子水清洗5‑10分钟后烘干备用；(2)制备生物素化聚吡咯钛片：以步骤(1)所得的钛片为工作电极、铂片为对电极，饱和汞电极为参比电极，以含有吡咯和生物素的水溶液为电解液，进行三电极体系电化学反应，将制备好的生物素化聚吡咯钛片用环氧乙烷消毒后，在浓度为10‑20μg/mL的链霉亲和素中4℃孵育过夜，再采用PBS缓冲液于4℃保存备用；(3)制备脂肪干细胞微泡：选取自培养至第3代到第5代的脂肪干细胞，经过多次超速离心后，弃上清，将超离管倒扣至无菌纱布上，沥干，采用PBS重悬沉淀后，得到脂肪干细胞微泡溶液，在100000g×1h下，4℃超速离心得到所需要的脂肪干细胞微泡沉淀；(4)制备生物素化的脂肪干细胞微泡：取一定质量的磷脂聚乙二醇生物素溶解到无水乙醇溶液中，并搅拌使其充分溶解，配置成浓度为1mmol/L的磷脂聚乙二醇生物素溶液；向步骤(3)中所得的脂肪干细胞微泡沉淀依次滴加DiluentC稀释剂溶液和磷脂聚乙二醇生物素溶液，然后在16000g×1h于4℃超速离心，PBS重悬沉淀得到生物素化的脂肪干细胞微泡；(5)取一定量的步骤(4)得到的生物素化的脂肪干细胞微泡悬液滴加到步骤(2)制备好的生物素化聚吡咯钛片上，室温下孵育1‑3小时，得到所述负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片。...

【技术特征摘要】
1.一种负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)钛片的预处理：将钛棒加工成方形钛片，金相砂纸打磨至1200目，依此用丙酮、乙醇、去离子水清洗5-10分钟后烘干备用；(2)制备生物素化聚吡咯钛片：以步骤(1)所得的钛片为工作电极、铂片为对电极，饱和汞电极为参比电极，以含有吡咯和生物素的水溶液为电解液，进行三电极体系电化学反应，将制备好的生物素化聚吡咯钛片用环氧乙烷消毒后，在浓度为10-20μg/mL的链霉亲和素中4℃孵育过夜，再采用PBS缓冲液于4℃保存备用；(3)制备脂肪干细胞微泡：选取自培养至第3代到第5代的脂肪干细胞，经过多次超速离心后，弃上清，将超离管倒扣至无菌纱布上，沥干，采用PBS重悬沉淀后，得到脂肪干细胞微泡溶液，在100000g×1h下，4℃超速离心得到所需要的脂肪干细胞微泡沉淀；(4)制备生物素化的脂肪干细胞微泡：取一定质量的磷脂聚乙二醇生物素溶解到无水乙醇溶液中，并搅拌使其充分溶解，配置成浓度为1mmol/L的磷脂聚乙二醇生物素溶液；向步骤(3)中所得的脂肪干细胞微泡沉淀依次滴加DiluentC稀释剂溶液和磷脂聚乙二醇生物素溶液，然后在16000g×1h于4℃超速离心，PBS重悬沉淀得到生物素化的脂肪干细胞微泡；(5)取一定量的步骤(4)得到的生物素化的脂肪干细胞微泡悬液滴加到步骤(2)制备好的生物素化聚吡咯钛片上，室温下孵育1-3小时，得到所述负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片。2.根据权利要求1所述的负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的电解液的制备方法是：将81.7mg十二烷基苯磺酸钠、201.3mg吡咯与7.3mg生物素加入到30mL去离子水中搅拌均匀溶解后得到。3.根据权利要求1所述的负载脂肪干细胞微泡的生物素化钛片的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雳风，孙家明，汪振星，韦炜，刘再鹏，牟珊，李芳颖，周楚超，李嘉伦，刘绍恺，曾宇阳，黎媛，罗超，侯金飞，方慧敏，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42