三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法技术

本发明专利技术涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法。一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，所述试剂盒包括10种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；本发明专利技术相对于现有技术的优点在于：本发明专利技术可通过切换不同最大发射波长，实现三种乳腺癌标志物的同时检测。

A fluorescence detection kit for the simultaneous detection of three tumor markers in breast cancer and its detection method

The invention relates to a method for measuring or testing enzymes or microorganisms, in particular to a fluorescence detection kit for simultaneous detection of three breast cancer markers and a detection method. For the three kinds of fluorescence detection kit for detection of tumor markers in breast cancer at the same time, the three kinds of tumor markers in breast cancer were CEA, CA153, CA125, the kit includes 10 kinds of solution, respectively G1 solution, G2 solution, G3 solution, Q1 solution, Q2 solution, Q3 solution; the invention has the advantages relative to the existing technology is that: the invention can be switched through the different maximum emission wavelength, three kinds of breast cancer markers and detection.

【技术实现步骤摘要】
一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法
：本专利技术涉及包含酶或微生物的测定或检验方法，具体涉及一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒及检测的方法。
技术介绍
：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年发病人数超过115万，每年约有41万人死于乳腺癌，在我国京、津、沪等大城市，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一位，死亡率占第四位，成为妇女健康的最大威胁之一。尽管目前诊断治疗水平比以往有所提高，但是乳腺癌病人的死亡率仍然居高不下，咎其原因是乳腺癌早期症状不明显，病人多以乳块就诊，待明确诊断时已属中晚期，大多数患者有不同程度的转移，虽经手术，化疗，放疗，很多乳腺癌患者疗效并不满意。乳腺癌早期发现、早期诊断、早期治疗具有重要意义，是提高乳癌患者生存率，延长乳腺癌患者生命的关键所在。目前，临床常用的乳腺癌检测方法包括：超声检查，钼靶摄片检查，近红外线扫描检查，磁共振技术(MRI)、纤维管内窥镜和微创活检等。钼靶摄片检查是目前乳腺筛查的首选，具有痛苦相对较小，简单易行的优点，但对40岁以下女性人群其胸腺腺体密度大，乳房X线钼靶筛查易产生假阴性结果。超声检查和近红外线扫描也同样具有检查方法灵敏度有限，假阳性和假阴性率高的问题。MRI技术具有较高的分辨率，但价格昂贵，且它需要向血管内注射造影剂，属于一种创伤性的检查措施，因此不适于大规模的人群普查。活检被认为目前乳癌确诊的金标准，但和纤维管内窥镜技术一样，属于创伤性诊断方式，对患者身体和组织具有一定程度的创伤，且具有一定人群局限性。随着对乳腺癌研究的不断深入，肿瘤血清标志物已成为乳癌早期诊断的研究热点。这些物质正常人体内缺乏或含量极低，但通常在肿瘤发生的早期即产生，并随着疾病发展和治疗而发生变化，因此监测其含量对肿瘤早期诊断、指导治疗、监测复发、转移及判断预后均具有重要意义。对肿瘤血清标志物的检测属于生物化学诊断，方法具有创伤小、简单、可重复性等优点。各国研究学者一致认为：一种肿瘤标志物单独检测特异性不强，对早期肿瘤的检出率低。多种标志物联合分析能够大大地弥补这些不足，而实现疾病的早期诊断通常需要3-4种标志物同时检测。现阶段临床上多采用酶联免疫法分别测定每种标志物，联合分析以提高疾病诊断的准确率和阳性率，每种标志物需要一种试剂盒，直接导致这些多组分检测方法普遍存在所需血清用量大、检测时间长、诊断费用高、操作复杂等不足。发展一种血清用量小、检测时间快、诊断费用低、操作简单、适合推广的多组分同时检测新技术，是目前乳腺癌早期诊断技术能够取得重大突破的正确方向之一。氧化石墨烯(GO)是由氧化石墨剥离而来，含有丰富的含氧功能基团(-O-，-OH，和-COOH)，其表面的含氧功能团使其具有两亲性，增加了其在水溶液中的稳定性。GO在光学、电化学等方面具有独特的优越性。在光学方面，GO对荧光具有较好的淬灭的作用，吸附于其表面的荧光分子的荧光可通过荧光能量转移被淬灭。荧光量子点是2-10nm的无机纳米晶体，具有独特的光学和化学特性，其光学属性可通过材料成分，粒径大小，粒度分布，表面化学等得到控制，并且具有量子产率高，激发光谱宽，发射光谱窄且对称性好特点。激发光谱宽和发射光谱窄这一特点，使不同粒径的荧光量子点可被同一波长激发，发射不同波长的荧光，为其在多组分肿瘤标志物同时测定中提供了优势。但是单一肿瘤标志物检测存在特异性不强，检测时间长等缺陷，存在较大的误差。
技术实现思路
：本专利技术针对单一肿瘤标志物检测特异性不强，检测时间长等问题，利用氧化石墨烯对量子点荧光的淬灭作用，发展了能用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，涉及的三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA，CA125，以及CA153。技术方案具体如下：一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，所述试剂盒包括6种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μgmL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联。作为优选方案之一，所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的。具体的实现过程可以为：所述G1液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。作为优选方案之二，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧光量子点上形成的；具体的实现过程可以为：所述Q1液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，过程包括：步骤1：将标记了CEA抗体的荧光量子点溶液、标记了CA153抗体的荧光量子点溶液、标记了CA125抗体的荧光量子点溶液加入96微孔板中；步骤2：向步骤1中加入待测血液样品；步骤3：然后分别加入标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液、标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液、标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液；步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为60-120min步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长应为400nm以下，发射波长应选460nm，540nm和620nm；步骤6：将上述血液样品所产生的荧光信号与采用三种乳腺癌标志物标准品进行测试所得出的标准曲线进行对照，即可获得本样本中三种乳腺癌标志物的含量；扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线性范围为1.5fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中y1为扣空白荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；扣空白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为1nUmL-1-10μUmL-1，回归方程为y2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣空白荧光信号值，x2为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；扣空白荧光信号强度与CA125含量之间线性范围为1μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3)+10.987，其中y3为扣本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，其特征在于，所述试剂盒包括6种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL

【技术特征摘要】
1.一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，其特征在于，所述试剂盒包括6种溶液，分别为G1液，G2液，G3液，Q1液，Q2液，Q3液；所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μgmL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联。2.根据权利要求1所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述G1液，G2液，G3液是分别将CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原直接标记在氧化石墨烯上形成的。3.根据权利要求2所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述G1液、G2液、G3液是分别使用第一活化试剂将氧化石墨烯进行活化处理，离心去除上清液后用PBS重悬，再加入抗原进行反应，经离心分离，洗涤，BSA封闭，得到；其中第一活化试剂为EDC和NHS的混合物，二者的摩尔比为1:1。4.根据权利要求1所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别将抗体直接标记在羧基修饰的荧光量子点上形成的。5.根据权利要求4所述一种用于三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述Q1液、Q2液、Q3液是分别使用第二活化试剂将羧基修饰的荧光量子点进行活化处理，再加入抗体进行反应，经BSA封闭，离心洗涤，PBS重悬得到抗体标记的荧光量子点溶液；其中第二活化试剂为EDC。6.三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，所述三种乳腺癌肿瘤标志物分别为CEA、CA153、CA125，其特征在于，需要用到的液体包括：G1液、G2液、G3液、Q1液、Q2液、Q3液；所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μgmL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA125抗体分别偶联；过程包括：步骤1：将Q1液，Q2液，和Q3液按照1:1:1体积比混合均匀，得A混合液；将G1液，G2液，和G3液按照1:1:1体积比混合均，得B混合液；步骤2：将200倍稀释的待测血清加入96微孔板中；步骤3：然后加入与稀释后待测血清体积相同的A混合液、体积为稀释后待测血清体积4倍的B混合液；步骤4：进行温育，温度为37摄氏度，温育时间为60-120min步骤5：将混合溶液放入酶标仪中检测荧光信号，荧光激发波长应为400nm以下，分别测定各孔在460nm，540nm和619nm处的荧光强度；步骤6：将上述血液样品所产生的荧光信号与采用三种乳腺癌标志物标准品进行测试所得出的标准曲线进行对照，即可获得本样本中三种乳腺癌标志物的含量；扣空白荧光信号强度与CEA含量之间线性范围为1.5fg-15ng，回归方程为y1＝2.0195lg(x1)+16.817，其中y1为扣空白荧光信号值，x1为CEA的含量，x1的单位为fg；扣空白荧光信号强度与CA153含量之间线性范围为1nUmL-1-10μUmL-1，回归方程为y2＝4.5201lg(x2)+19.767，y2为扣空白荧光信号值，x2为CA153的含量，x2的单位为nUmL-1；扣空白荧光信号强度与CA125含量之间线性范围为1μUmL-1-1mUmL-1，回归方程为y3＝5.275lg(x3)+10.987，其中y3为扣空白荧光信号值，x3为CA125含量，x3单位为μUmL-1。7.根据权利要求6所述三种乳腺癌肿瘤标志物同时检测的方法，其特征在于，所述G1液为标记了CEA抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为5μgmL-1；所述G2液为标记了CA153抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为10μgmL-1；G3液为标记了CA125抗原的氧化石墨烯溶液，浓度为100μgmL-1；所述三种氧化石墨烯表面具有羧基基团，所述羧基基团与对应的CEA抗原、CA153抗原、CA125抗原分别偶联；所述Q1液为标记了CEA抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为620nm；所述Q2为标记了CA153抗体的荧光量子点溶液，浓度为9.6μM,最大发射波长为540nm；Q3为标记了CA125抗体的荧光量子点溶液，浓度为1μM，最大发射波长为460nm；所述三种荧光量子点为经过表面修饰使其带有羧基的荧光亮子点；所述羧基基团与对应的CEA抗体、CA153抗体、CA1...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊爱萍，杨洪丽，于晓倩，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12