基于ubiquitin‑1启动子的植物抗蚜性实现方法技术

一种基于ubiquitin‑1启动子的植物抗蚜性实现方法，利用基因工程手段从椒样薄荷中克隆到EβF合成酶(E‑β‑farnesenesynthase,EβFS)基因(EβF)，构建ubiquitin‑1启动子驱动EβF载体，将该基因通过基因枪转化方法转入小麦，在小麦中催化FPP合成[反]‑β‑法呢烯，通过在小麦中合成蚜虫警报素[反]‑β‑法呢烯，达到转基因小麦释放[反]‑β‑法呢烯，从而趋避蚜虫的作用。

Anti aphid ubiquitin 1 promoter plant method based on

A ubiquitin 1 promoter of plant based on aphid resistance method, using genetic engineering means from peppermint cloned E beta F synthase (E beta farnesenesynthase E beta FS gene (E), beta F) to construct ubiquitin 1 promoter driven E beta F carrier, will be transferred to wheat the gene by gene gun transformation in Wheat in catalytic synthesis of FPP [beta] - farnesene in wheat aphid, through the synthesis of alarmins [] anti beta farnesene, to release transgenic wheat [] anti beta farnesene, thus aversion of aphids.

【技术实现步骤摘要】
基于ubiquitin-1启动子的植物抗蚜性实现方法
本专利技术涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种基于ubiquitin-1启动子驱动EβF基因的增强植物抗蚜性的方法。
技术介绍
蚜虫是农业生产中的主要害虫之一，我国小麦主要种植地区小麦生育期间气温升高，出现“暖冬”，致使蚜虫危害猖獗，每年在小麦生产上因蚜虫及其传播的病毒所造成的经济损失十分严重。由于目前我国小麦主栽品种对蚜虫的抗性都不强，如何有效防治蚜虫已成为小麦生产上的重大问题之一。农药在抵抗虫害中起着重要作用，然而害虫对农药逐渐产生抗药性，此外，农药还容易污染环境。转基因技术在帮助农作物抵抗咀嚼式口器的害虫方面作出了重大贡献。例如，转Bt毒蛋白的棉花对于棉铃虫具有高抗效果。因此，防治蚜虫是一个刻不容缓的世界性课题。[反]-β-法呢烯(E-β-farnesene)是广泛存在于植物和动物中的倍半萜。大量研究结果表明，[反]-β-法呢烯是蚜虫报警信息素的主要成分。当蚜虫受到天敌捕食或者拟寄生物攻击时，植物会释放出[反]-β-法呢烯，使周围的蚜虫感知并迅速逃离。
技术实现思路
本专利技术提出一种基于ubiquitin-1启动子的植物抗蚜性实现方法，与化学防治相比，利用基因工程手段获得的抗虫转基因植物具有只对目标害虫有效，而对非危害生物没有影响的优点，植物表达产生的抗虫物质存在于植物体内，不会对环境造成污染，且成本低，利于推广。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术涉及一种具有抗蚜虫功能的基因，具体为合成酶基因EβFS，从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到，其核苷酸序列如序列1所示。本专利技术涉及一种基于ubiquitin-1启动子的植物抗蚜性实现方法，通过从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到EβF合成酶基因EβFS，通过构建表达载体并将该基因采用基因枪方法导入小麦中，实现小麦抗蚜性的增强。所述的表达载体，即ubiquitin-1启动子驱动EβF载体，通过将椒样薄荷EβFS基因连于植物过量表达载体上，构建得到含EβFS基因序列的植物过量表达载体。所述的ubiquitin-1启动子具体为：pDE1005的组成型启动子。技术效果与现有技术相比，本专利技术对于适用于本专利技术的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物或林业植物等。附图说明图1为本专利技术pDE1005:proUBI:EβFS载体构建示意图；图2为实施例中转ubiquitin-1启动子驱动EβFS基因T1代小麦PCR鉴定示意图；图中：M：DL2000marker；+：pDE1005:proUBI:EβFS质粒；CK：野生型Fileder春小麦；1-1，1-3，1-5，2-3，2-5，2-6，3-1，3-5，3-6：转ubiquitin-1启动子驱动EβFS基因T1代小麦植株，简称EB。图3为实施例中转ubiquitin-1启动子驱动EβFS基因T1代小麦半定量PCR分析示意图。具体实施方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdspringharborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂盒均为市售或公开渠道可以获得的试剂盒。实施例1椒样薄荷EβF基因的克隆1.椒样薄荷基因组总RNA的提取：取椒样薄荷叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN生化科技有限公司植物总RNA试剂盒的说明书抽提总RNA。用琼脂糖胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2.椒样薄荷EβF基因的克隆：以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据EβF基因的序列设计基因特异性引物，通过PCR从总cDNA中扩增EβF基因，并测序。通过上述步骤，获得了椒样薄荷EβF基因的全长1650bp，其核苷酸编码序列如SEQIDNO.1所示，并推导出其蛋白编码序列如SEQIDNO.2所示，其中，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。表1扩增中所采用的PCR引物引物名称引物序列(5’→3’)EβF-FP1ATGGCTACAAACGGCGTCGTAAEβF-RP1TCAAAAGACTATGGCATCAATAA表2PCR的反应体系实施例2含EβF基因的植物过量表达载体的构建将EβF基因部分序列利用重组酶构建在植物过量表达载体(pDE1005)上，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了SpeI的酶切位点，反向引物中引入了SacI的酶切位点，引物如表3所示，其启动子为ubiquitin-1启动子；表3pDE1005-EβF体构建的PCR引物实施例3基因枪法转化小麦幼胚获得转基因小麦植株1.幼胚培养：选取开花后14d左右的幼穗，收集适当大小的籽粒(幼胚大小为1.0-1.5mm)，在超净工作台内用70％乙醇表面消毒30s，10％次氯酸钠消毒10-12min，无菌水冲洗3次，轻轻剥取幼胚，接种在SD2培养基上诱导愈伤组织。2.基因枪转化小麦幼胚：接种8d左右的幼胚愈伤组织用做外源基因的受体。含有目的基因的质粒DNA包裹金粉子弹进行转化。基因枪轰击前将受体在高渗透压培养基(SD2+0.4molL-1山梨醇)上预处理4h。轰击后的愈伤组织在高渗透压培养基上继续放置16h，转移到SD2培养基上进行14d的恢复培养，然后转移到1/2MS添加除草剂35mgL-1的培养基上进行愈伤组织筛选并分化成苗。移栽生长健壮的抗性植株到花盆中。3.转基因小麦的PCR检测：利用pDE1005-EβF体构建的PCR引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段。而以非转化小麦基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。本实施例将所述利用基因枪法转化小麦幼胚，获得经PCR检测的转基因小麦植株。实施例4转ubiquitin-1启动子驱动EβFS基因T1代小麦目的基因半定量分析用TIANGEN生化科技有限公司RNA抽提试剂盒(RNAplantPlus植物总RNA提取试剂)从转ubiquitin-1启动子驱动EβFS基因T1代小麦和非转基因小麦(CK)的叶片中提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA浓度，用Takara公司RTreagentKit(PerfectRealTime)将RNA反转录为cDNA。设计半定量基因(EβFS-RT-FP：TGGGATACCATTACGAACCTCAG，EβFS-RT-RP：GTGAGAGCCAATGTCATCCCAA)和内参(ACTIN)(ACTIN-RT-FP：CCAACAGAGAGAAAATGACCCAGA，ACTIN-RT-RP：AACCTCCACTGAGAACAACATTACC)引物引物，由上海生工合成。PCR反应体系为：正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，2XPremix10μM，DNA模板(样品)(100ng/μL)2μL，加ddH2O至20μL。PCR反应参数为：94℃10min，1cycle；94℃40s，55℃40s，72℃40s，28cycles本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗蚜虫功能的基因，其特征在于，具体为合成酶基因EβFS，从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗蚜虫功能的基因，其特征在于，具体为合成酶基因EβFS，从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到。2.一种基于ubiquitin-1启动子的植物抗蚜性实现方法，其特征在于，通过从椒样薄荷Mentha×piperita中克隆得到EβF合成酶基因EβFS，通过构建表达载体并将该基因采用基因枪方法导入小麦中，实现小麦抗蚜性的增强。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的表达载体为玉米ubiquitin-1启动子驱动EβF载体，通过将椒样薄荷EβFS基因连于植物过量表达载体上，构建得到含EβFS...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，马嘉伟，付雪晴，张婷婷，赵静雅，谢利辉，黎凌，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31