一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2及其克隆方法与应用，提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明专利技术还公开了提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定

A method to improve the potassium content of tobacco leaves NtNHX1 2 gene and its cloning method and Application

The invention discloses a method for improving tobacco leaf potassium content of 2 NtNHX1 gene and its cloning method and application, improve the potassium content of tobacco leaf gene NtNHX1 2 nucleotide sequence of SEQ ID:No.1, encoding amino acid is shown as SEQ ID:No.2. The invention also discloses a method for cloning 2 increase in tobacco leaf potassium content of NtNHX1 gene, specific steps include: A, determination

【技术实现步骤摘要】
一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2及其克隆方法与应用。
技术介绍
植物主要通过位于细胞膜或液泡膜上的Na+/H+反向转运蛋白来维持细胞质内Na+和K+的浓度。拟南芥AtNHX1基因的克隆及功能验证表明，NHX1在植物中发挥Na+/H+反向转运功能（Apseetal.,1999，Science,285:1256-1258）。由于NHX蛋白在平衡细胞内Na+浓度的作用，目前对其生物学功能的研究主要集中在植物耐盐胁迫方面，过表达AtNHX1基因后，可以显著提高拟南芥（Apseetal.,1999，Science,285:1256-1258））、油菜（Zhangetal.,2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98:12832-12836）和番茄（ZhangandBlumwald.,2001，Nat.Biotechnol.19:765-768）的耐盐性。在过表达AtNHX1的转基因番茄中，AtNHX1也表现了K+/H+转运体功能（ZhangandBlumwald.,2001，Nat.Biotechnol.19:765-768）。AtNHX1和AtNHX2基因双突变株系不能将K+泵入液泡，同时使胞液K+浓度升高（Barragánetal.,2012，PlantCell,24(3):1127-42）。表明AtNHX1和AtNHX2两个转运体在K+从胞液泵入液泡中起着关键作用。钾被认为是烟草的品质元素，钾含量是评价烟叶品质优劣的重要指标之一。烟叶钾含量提高可以改善烟叶的组织结构，使烟叶结构细腻，而且还能提高烟叶外观色泽，使烟叶呈深橘黄色，香气足，吃味好，富有弹性和韧性，填充性增强。另外钾还可以增强烟叶糖类、色素类、芳香类物质的合成积累。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2；第二目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法；第三目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、确定NtNHX1-2基因序列；根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2用于获得叶片高钾含量的转基因植株中的应用。本专利技术通过植物基因工程技术，利用同源克隆法及PCR技术，分离鉴定烟草钾转运体基因NtNHX1-2序列信息，并通过农杆菌侵染法将该基因在烟草云烟87中过表达，经过qPCR检测筛选NtNHX1-2过表达的转基因T1代植株进行种植，对收获的烟叶进行钾含量检测，获得钾含量提高的烟草植株。获得的转基因植株钾含量比对照提高20%以上。说明烟草NtNHX1-2基因在培育高钾含量的烟草方面具有重大的应用前景。附图说明图1为NtNHX1-2基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，NtNHX1-2大小为1611bp；图2为NtNHX1-2连接载体TOPO后，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和3500bp左右两条片段；图3为NtNHX1-2连接入门克隆载体pENTR™2B后，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和3800bp两条片段；图4为植物表达载体pK2GW7-NtNHX1-2的酶切鉴定，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出1611bp和11kb左右两条片段；图5为过表达NtNHX1-2基因转基因T1代株系qPCR分析，PN1-5，PN1-15，PN1-18为转基因株系，VC为转空载体对照；图6为转基因烟草株系T1代烟叶钾含量，PN1-5，PN1-15，PN1-18为转基因株系，VC为转空载体对照。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，包括以下步骤：A、确定NtNHX1-2基因序列；根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；本专利技术所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体为pK2GW7-NtNHX1-2。本专利技术所述的提高烟草叶片钾含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1‑2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、确定NtNHX1-2基因序列；根据水稻NHX1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtNHX1-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：NtNHX1-2F：GGATCCATGGCGTCTGAGCTGGCTTCT；反向引物：NtNHX1-2R：CTCGAGTCATGGTTCCTGTTCCGTTGG；B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtNHX1-2F/NtNHX1-2R进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。4.根据权利要求3所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。5.根据权利要求3所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的克隆方法，其特征在于C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。6.一种权利要求1或2所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的过表达载体为pK2GW7-NtNHX1-2。7.一种权利要求1或2所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用，其特征在于所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2用于获得叶片高钾含量的转基因植株中的应用。8.根据权利要求7所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtNHX1-2的应用，其特征在于用于获得叶片高钾含量的转基因植株的方法包括以下步骤：A、过表达载体构建：一、克隆的NtNHX1-2连接TOPO载体（1）以云烟87叶片的cDNA为模板，利用NtNHX1-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为1.6kb的基因片段，纯化回收；（2）将回收的NtNHX1-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，挑选扩增产物大小约为1.6kb的质粒提取DNA，构建的载体命名为pTOPO-NtNHX1-2；（3）由于基因正反游引物分别带有BamHI、XhoI的识别位点，因此选择这两个酶对质粒DNA样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和1.6kb左右，说明目的片段已插入TOPO载体；二、植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，宋中邦，王丙武，李文正，焦芳婵，吴玉萍，吴兴富，李梅云，邹聪明，李永平，徐向丽，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53