本发明专利技术公开了热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用，属于工业生物技术领域。将来源于Brevibacillus parabrevis CGMCC No.10798的角蛋白酶第181位天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸进行定点突变改造，并对上述位点进行随机组合制备获得组合突变体。本发明专利技术实现了角蛋白酶热稳定性的1～4.09倍的显著提高，具有良好的理论价值和应用前景。
Thermally stable keratin mutant and its application
The invention discloses the angular protease mutant of thermal stability and its application, which belongs to the field of industrial biological technology. The future source of keratinase in 181st Brevibacillus parabrevis CGMCC No.10798 ASN, Tyr 218th, 236th serine modification site directed mutagenesis, and the site of a random combination preparation for a combination of mutants. The invention has achieved a remarkable improvement in thermal stability of keratin from 1 to 4.09 times, and has good theoretical value and application prospect.
【技术实现步骤摘要】
热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用
本专利技术涉及热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用，属于工业生物
技术介绍
角蛋白是一类难降解的不溶性蛋白质，广泛存在于自然界，是继纤维素和壳聚糖之后的第三大类聚合物。在脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、角、指甲、喙及鱼的牙齿和粘液中含量丰富，作为一种结构蛋白，对动物体起保护作用，以使其能够应对自然界环境和其他生物的干扰。由于角蛋白富含二硫键、氢键和分子间疏水相互作用力，所以其结构致密、性质稳定，对许多化学品的作用不敏感，也难以被普通蛋白酶类降解。角蛋白酶可以将不溶性角蛋白特异性降解为可溶性蛋白或者多肽。由于具备独特的底物特异性，角蛋白酶在制革、洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域中表现出良好的应用前景。本专利技术的亲本酶副短短芽孢杆菌BrevibacillusparabrevisCGMCCNo.10798生产的角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在60℃保温30min后，残余酶活仅为38％，限制了该酶在工业生产中的产品开发和推广，尤其在洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域的应用过程中通常需要涉及到较高温操作、酶容易失活。为进一步提高该角蛋白酶在工业生产中的应用潜力，提高该酶的稳定性，从而节约成本、提升应用效率将成为角蛋白酶研究的重要方向。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种角蛋白酶的突变体，所述突变体以副短短芽孢杆菌BrevibacillusparabrevisCGMCCNo.10798角蛋白酶为亲本蛋白酶，是将亲本角蛋白酶的第181位的天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸中的至少一处突变为其他氨基酸。在本专利技术的一种实施方式中，是将第181位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，是将第218位酪氨酸突变为丝氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，是将第236位的丝氨酸突变为半胱氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述亲本蛋白酶的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.1～3中的任一种。本专利技术的第二个目的是提供编码所述蛋白酶突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pMD系列、pET系列中任意一种。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为载体pET22b(+)。本专利技术的第四个目的是提供表达所述角蛋白酶突变体的细胞系。在本专利技术的一种实施方式中，宿主细胞可选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)、酵母、丝状真菌(Filamentousfungi)中的任意一种。本专利技术的第五个目的是提供一种提高角蛋白酶热稳定性的突变体的方法，包括以下步骤：(1)在BrevibacillusparabrevisCGMCCNo.10798角蛋白酶氨基酸序列的基础上，利用在线服务器TM-score分析角蛋白酶的立体结构中氨基酸的标准化B-factor值，选择不稳定的loop环结构区域氨基酸作为突变位点；或通过氨基酸序列比对寻找差异的特征氨基酸残基作为突变位点；(2)设计突变处氨基酸定点突变的突变引物，以携带角蛋白酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(3)将突变体质粒转化进宿主细胞；(4)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化角蛋白酶突变体。本专利技术还提供所述角蛋白酶突变体在生物、食品、化工领域的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括用于洗涤、角蛋白废弃物降解或饲料加工。有益效果，本专利技术实现了角蛋白酶突变体的热稳定性的提高。与野生酶相比，T218S、S236C和N181D突变酶60℃的半衰期分别延长3.05倍、1.18倍和1倍，T50也分别提高5.4℃、2.8℃和2℃；双突变体N181D-T218S和N181D-S236C的比酶活分别提高58％和15％；T50分别提高5.1和2.9℃；60℃下的半衰期分别是WT的4.09倍和1.54倍；最适反应温度分别提高10℃和5℃，角蛋白酶突变体比亲本在工业应用中具有更好的应用前景。热稳定性的提升对于酶的应用价值促进作用主要体现在能使酶的操作稳定性提高、使酶的使用周期延长、减少酶用量及降低使用成本、并且能耐受较高温度操作条件。附图说明图1为野生酶和突变酶在60℃的失活曲线图；图2为野生酶与单点突变酶的最适温度；图3为野生酶与单点突变酶的最适pH；图4为野生酶和突变酶对应的RMSD曲线；图5为野生型WT与突变体N181D、T218S、S236C和N181D-T218S突变位点附近区域氢键比较.A0，WT的181位附近；A1，N181D附近；B0，WT的218位附近；B1，T218S的218位附近；C0，WT的236位附近；C1，S236C的236位附近；D0，WT的181和218位附近；D1，N181D-T218S的181和218位附近；图6为野生型WT与突变体N181D、S236C、N181D-T218S在181位、236和181-218位氨基酸的表面电荷比较.左侧：A0、B0和C0，WT；右侧：A1，N181D；B1，S236C；C1，N181D-T218S。具体实施方式角蛋白酶酶活测定方法：以1％角蛋白为底物，采用紫外比色法测定酶活性。取稀释适当倍数的酶液0.5mL，加入1.5mL的底物，在40℃条件下保温15min后，加入2mL的0.4MTCA溶液，静置10min后将样品于12000r·min-1条件下离心5min，取上清500μL，加入2500μL的0.4MNa2CO3和500μL的福林酚试剂，混合均匀后在40℃保温条件下反应20min显色后，检测OD660。酶活定义：在上述反应体系中，波长660nm下的吸光度每增加0.01为1个酶单位(U·mL-1)。角蛋白酶的半衰期测定：将适量亲本和各突变体酶液置于60℃保温，间隔10min取样测定其残余酶活。以时间为恒坐标，拟合相对酶活为纵坐标，根据公式t＝ln2/k求得酶在60℃下的半衰期(t(1/2，60℃))；角蛋白酶T50的测定：将亲本酶和各突变体酶液置不同温度保温(40-65℃)，间隔取样后迅速冰浴处理，测定残余酶活；以冰浴相同时间的角蛋白酶活力定义为100％。实施例1角蛋白酶定点单突变体的制备根据BrevibacillusparabrevisCGMCCNo.10798角蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO.4所示)，分别设计引入T218S、N181D和S236C突变的引物，将亲本角蛋白酶(WT)的第181位的天冬酰胺(Asn)突变为天冬氨酸(Asp)、氨基酸序列为SEQIDNO.1；将第218位酪氨酸(Tyr)突变为丝氨酸、其氨基酸序列为SEQIDNO.2；将第236位的丝氨酸(Ser)突变为半胱氨酸(Cys)、氨基酸序列为SEQIDNO.3，对角蛋白酶基因进行定点突变，测定其DNA编码序列，分别将突变体基因置于表达载体并导入表达宿主大肠杆菌中进行表达，得到单点突变角蛋白酶，单突变体T218S、N181D和S236C利用PCR技术，以表达载体pET22b-bpker为模板，引入N181D定点突变的引物为：N181D-F：5’-TTGCCAATGTA(GAT)AGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种角蛋白酶的突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.4所示的角蛋白酶为亲本角蛋白酶，将亲本角蛋白酶的第181位的天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸中的至少一处突变为其它氨基酸。
【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶的突变体，其特征在于，以SEQIDNO.4所示的角蛋白酶为亲本角蛋白酶，将亲本角蛋白酶的第181位的天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸中的至少一处突变为其它氨基酸。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将第181位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将第218位酪氨酸突变为丝氨酸。4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将第236位的丝氨酸突变为半胱氨酸。5.编码权利要求1-4任一所述蛋白酶突变体的基因。6.携带权利要求4所述基因的载...
【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，许正宏，张荣先，龚劲松，李恒，苏畅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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