内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A-h47及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A‑h47及其应用。一种编码所述内切葡聚糖酶的基因cel5A‑h47，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。生物信息学分析表明，该基因编码的内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族。发明专利技术人通过设计引物成功将其克隆，并在原核表达系统中成功表达，经诱导超声纯化所得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为5.0，最适温度为50°C，在50°C以下能保持相对稳定的酶活性，具有较强的pH耐受性，在pH4.0‑10.0下能保持较高的酶活性。该重组内切葡聚糖酶具有较大的研究和工业应用潜力。

Endoglucanase gene cel5A, encoding the H47 and its application

【技术实现步骤摘要】
内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A-h47及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A-h47及其应用。
技术介绍
纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，是目前自然界中最丰富的可再生资源，然而其顽固的结构限制了它的利用。纤维素降解成葡萄糖的过程需要内切葡聚糖酶(endoglucanase，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，E.C.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21)三种纤维素酶的系统同作用。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链中的β-1,4糖苷键，切断纤维素长链，转化为大量不同聚合度的短链，降低纤维素的聚合度，在降解过程中发挥关键的作用。因此，它的生产利用对于纤维素的降解效率至关重要。目前，该酶已经广泛应用于造纸、纺织、食品、生物燃料、动物饲养等行业中。这些产业上的应用需要生产成本低，具有不同的最适pH和温度，以及较好稳定性的内切葡聚糖酶。过去几十年，大量的研究集中在如何减少真菌生产纤维素酶的成本，主要包括菌的随机诱变、工业优化、外源蛋白添加等方法。然而，由于缺乏对复杂酶系和产酶菌的充分了解，这一进程相当缓慢。因此，寻找大量新型的内切葡聚糖酶尤为重要。随着组学的出现，一些产木质纤维素酶的微生物基因组测序陆续完成，为进一步的研究提供了清晰的遗传背景，越来越多的纤维素酶基因核苷酸序列得以确定，并在大肠杆菌和酵母中得到了表达，有效地补充了传统的酶系统。而转录组测序能够提供基因cDNA序列和基因的表达水平，能够真实反映蛋白在体内的表达情况，因此，从环境微生物转录组信息中发掘内切葡聚糖酶基因是比较新颖，同时也是行之有效的研究方向。
技术实现思路
本专利技术提供一种新型的内切葡聚糖酶基因cel5-h47，其原核表达后重组酶Cel5-H47为嗜中温酶，50℃下能保持较高的酶活性；最适反应温度为50℃，最适pH为5.0；具有很强的pH耐受性，在pH4.0-10.0下均能保持较高酶活性。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。一种编码所述内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶基因cel5A-h47，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术内切葡聚糖酶基因cel5A-h47来自湖羊瘤胃微生物转录组数据。一种包含所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47的重组载体。一种包含所述木聚糖酶基因cel5A-h47的重组菌。一种制备内切葡聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到内切葡聚糖酶。扩增所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47采用的特异性引物，所述的特异性引物为：H47-F：5’ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGTGACCATGAATTTTGTTACCGTAAG3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；H47-R：5’CTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATGAAGCCGCTCCGTCCA3’，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47的获取方法如下a、cel5A-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及重组质粒pET-28a/cel5A-h47的构建；b、重组质粒pET-28a/cel5A-h47在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达；c、重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析；作为优选，步骤acel5A-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及重组质粒pET-28a/cel5A-h47的构建过程具体如下：①PCR扩增内切葡聚糖酶编码基因cel5A-h47；②反向PCR扩增制备线性化pET-28a质粒；③同源重组法构成重组质粒pET-28a/cel5A-h47转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。本专利技术所述的内切葡聚糖酶在强碱性环境下的纤维素降解方面的应用，如碱性洗涤剂、纺织业等工业生产。所述的强碱性环境是pH大于7.0。进一步的，所述的强碱性环境是pH7.0-8.0。本专利技术具有下列优点和积极效果：1.本专利技术中所克隆的基因来自湖羊瘤胃微生物转录组数据，保证基因的新颖性。2.本专利技术中选用原核表达系统，具有遗传背景清楚、操作简便和生产周期短等优点。3.本专利技术中PCR扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产物特异性。4.本专利技术的内切葡聚糖酶在50℃以下具有较强耐受性，能保持较高的酶活性。5.本专利技术的内切葡聚糖酶具有较广的pH适应范围，在pH4.0-10.0范围内，均能保持较高活性(在pH4.0-8.0范围内，均能保持80％以上酶活性，在pH9.0-10.0范围内能保持65％以上酶活性)。因此可以用于强碱环境下的纤维素工业降解，如在洗涤剂、纺织等工业，相比传统酸性内切葡聚糖酶处理的纺织品会产生退色现象，本专利技术中内切葡聚糖酶可以在碱性环境中进行处理，避免此现象发生。附图说明图1是cel5A-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及表达策略；图2是克隆cel5A-h47PCR产物；图3是重组蛋白Cel5A-H47的SDS-PAGE分析图；图4是pH对Cel5A-H47酶活性的影响；图5是Cel5A-H47酶的pH稳定性；图6是温度对Cel5A-H47酶活性的影响；图7是Cel5A-H47酶的热稳定性。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：一、湖羊瘤胃内容物总RNA提取取-80℃冷冻保存的瘤胃内容物样品提取总RNA(以下裂解液RL、吸附柱RA、去蛋白液RE、漂洗液RW、RNaseFreeWater均购自艾德莱生物科技有限公司)在液氮中迅速研磨成粉末，每50～100mg样品加1ml的裂解液RL后匀浆，剧烈震荡混匀以裂解细胞。15-30℃下孵育5分钟使核蛋白体完全分解。12000rpm，4℃离心10min移除不溶物。将上清转移至一个干净的离心管，每1ml裂解液RL加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，12000rpm，4℃离心10min。取上层无色水相转移至新管中，加入水相体积一半的无水乙醇，混匀后加入吸附柱RA中，室温下12000rpm离心45s，弃上清。加入500μl去蛋白液RE，室温下12000rpm离心45s，弃上清。加入500μl漂洗液RW，室温下12000rpm离心45s，弃上清。再次加入500μl漂洗液RW，室温下12000rpm离心45s，弃上清。室温下13000rpm离心2min尽量除去漂洗液。将吸附柱RA放入RNasefree离心管中，在吸附膜中间部位加50-80μlRNaseFreeWater，室温放置2min,12000rpm离心1min，得到总RNA，-80℃保存。二、cel5A-h47基因的克隆cel5A-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及表达策略见图1。(1)以瘤胃内容物总RNA为模板，利用逆转录合成第一链cDNA(以下Random本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内切葡聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种内切葡聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种编码权利要求1所述内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶基因cel5A-h47，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。3.一种包含权利要求2所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47的重组载体。4.一种包含权利要求2所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47的重组菌。5.一种制备内切葡聚糖酶的方法，是发酵培养权利要求4所述的重组菌，得到内切葡聚糖酶。6.扩增权利要求2所述内切葡聚糖酶基因cel5A-h47采用的特异性引物，其特征在于所述的特异性引物为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳堃，何波，金舒文，高歌，李嘉秋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33