本发明专利技术公开了一种酶活提高的γ‑谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明专利技术的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，将第413位氨基酸由苏氨酸突变成半胱氨酸。本发明专利技术得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，γ‑谷氨酰转肽酶突变体酶的转肽反应活力较突变前提高12％，水解反应活力降低了50％。本发明专利技术表明413位氨基酸残基对γ‑谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明专利技术所得的γ‑谷氨酰转肽酶突变体可用于制备L‑茶氨酸。
A gamma glutamyl transpeptidase enzyme activity increased in the mutant and its construction method
【技术实现步骤摘要】
一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法
本专利技术涉及一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法，属于基因工程
技术介绍
L-茶氨酸，是存在于茶类植物中的一种天然氨基酸，决定茶叶的品质和风味，对人体具有多方面的健康功效，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量日益增加。目前，茶氨酸生产的研究主要集中在酶转化法，而其中γ-谷氨酰转肽酶又以其独特的优越性脱颖而出。γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT，EC2.3.2.2)负责催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰分子转移到其他氨基酸、短肽等受体分子上(转肽反应)或水分子上(水解反应)，广泛存在于哺乳动物和细菌中。当以L-谷氨酰胺为供体，乙胺为受体，γ-谷氨酰转肽酶催化转肽反应时，即可生成L-茶氨酸，该反应过程耗时短，不需要额外添加ATP，具有诸多优势。γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸突出的问题是，存在水解反应，造成副产物L-谷氨酸的合成。一般情况下通过优化控制供体和受体之间用量比例、调节pH等条件来优化反应，降低副产物的合成，但是副产物L-谷氨酸积累仍然存在。因此，本专利技术在上述优化的基础上，通过定点突变改造γ-谷氨酰转肽酶，进一步提高其转肽酶活力，降低水解反应，对于提高L-茶氨酸工业化生产效率和产率具有重要意义和应用前景。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种转肽活力提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。编码所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。所述突变体是在氨基酸如序列SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将413位氨基酸由苏氨酸突变成半胱氨酸。本专利技术还提供了一种表达所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的基因工程菌。所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第413位的苏氨酸的密码子突变成了编码半胱氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体是pMA5。在本专利技术的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：(1)以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDNO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因T413C。(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-T413C，重组质粒化转化B.subtilis168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-T413C/B.subtilis168。本专利技术在天然γ-谷氨酰转肽酶的基础上，通过定点突变生物技术改造γ-谷氨酰转肽酶分子结构，突变体酶的转肽反应活力较突变前提高12％，水解反应活力降低了50％。本专利技术表明413位氨基酸残基对γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应活力有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本专利技术所得可用于制备L-茶氨酸。具体实施方式实施例1含γ-谷氨酰转肽酶突变体的重组载体的构建(1)T413C突变体的获得：以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDNO.5所示)、Rprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因。(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-T413C。测序工作由上海生工完成。实施例2产γ-谷氨酰转肽酶枯草芽孢杆菌工程菌构建将实施例1得到的重组质γ-谷氨酰转肽酶粒pMA5-T413C化学法转化入B.subtilis168感受态细胞，具体方法如下：(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：Sp-A：(NH4)2SO44，K2HPO428，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO4·7H2O0.4100×CAYE：Casaminoacid20，酵母粉100SpI培养基：Sp-A49％，Sp-B49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE2％SpII培养基：SpI培养基98％，50mmol/LCaCl21％，250mmol/LMgCl21％。115℃湿热灭菌。(2)将B.Subtilis168的单菌落接种至2mLSpI培养基中(50mL离心管)，37℃、200r/min培养过夜；(3)取100μL培养液至5mLSpI培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；(4)取200μL培养液至2mLSpII培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL10mmol/LEGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-T413C，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌pMA5-T413C/B.subtilis168。实施例3重组菌pMA5-T413C/B.subtilis168γ-谷氨酰转肽酶高效表达及酶活测定。(1)将实施例2构建的重组菌pMA5-T413C/B.subtilis168与表达未突变的酶的对照菌株pMA5-ggt/B.subtilis168分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于枯草芽抱杆菌发酵培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。(2)枯草芽抱杆菌发酵培养基：蔗糖25g/L,胰蛋白胨5g/L,玉米浆15g/L,MgSO40.3g和K2HPO4·3H2O1g/L，添加卡那霉素至终浓度为50μg/ml，调节pH为7.2。(3)转肽酶活定义为：在37℃反应条件下，每分钟内由γ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺经转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。。(4)γ-谷氨酰转肽酶酶活测定方法：采用比色法测定，具体方法如下：取培养60h的菌液50mL，于4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1ml的标准反应体系中包含50mM硼酸盐-氢氧化钠(pH10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺，60mM双甘二肽,750mMNaCl和10μl适当稀释的酶液。37℃反应10min后添加2ml3.5N的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。(3)结果表明重组菌pMA5-T413C/B.subtilis168表达的γ-谷氨酰转肽酶的转肽酶活为16.4U/mL，比对照菌株pMA5-ansz/.subtilis168(13.6U/mL)γ-谷氨酰转肽酶转肽酶活提高12％。实施例4：γ-谷氨酰转肽酶突变体用于茶氨酸生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种γ‑谷氨酰转肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种γ-谷氨酰转肽酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述突变体的基因。3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。4.一种表达权利要求1所述γ-谷氨酰转肽酶突变体的基因工程菌。5.一种制备权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQIDNO.4所示序列的基础上，将第413位苏氨酸突变成半胱氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以SEQIDNO.3...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，杨套伟，张显，徐美娟，刘会灵，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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