一株异源表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的大肠杆菌重组菌制造技术

本发明专利技术公开了一株异源表达L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的大肠杆菌重组菌，属于生物工程领域。本发明专利技术通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶菌株，将重组菌株高密度发酵，以L‑Asp‑Na作为底物，进行全细胞催化反应制备β‑丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，与酶法相比，底物价格便宜，催化效率高，终产物β‑丙氨酸产率95％以上，简化产物的分离纯化步骤。

Recombinant Escherichia coli strain expressing L aspartate decarboxylase alpha

【技术实现步骤摘要】
一株异源表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的大肠杆菌重组菌
本专利技术涉及一株异源表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的大肠杆菌重组菌，属于生物工程

技术介绍
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，其用途广泛：工业上，是合成泛酸钙的重要原料，也是合成肌肽的两种氨基酸之一；医药上，作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮，同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法，或β-氨基丙腈水解法，这些方法多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题。因此使用生物催化法替代化学合成法制备β-丙氨酸是发展趋势。目前生物合成法主要有两种，一种是优化代谢途径，在培养微生物过程中合成β-丙氨酸，此法虽然较简便，但是由于微生物代谢过程中会产生大量副产物，对产物的分离纯化带来较大困难，增加了后期纯化成本；另一种方法是生物酶法合成β-丙氨酸，即通过表达L-天冬氨酸α-脱羧酶，以L-天冬氨酸作为底物，脱去α-羧基生成β-丙氨酸，分离纯化简便。编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因pand被发现广泛地存在于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌、沙门氏菌等微生物中，目前研究较广的Pand主要是来自于原核生物，但原核生物来源的Pand酶活较低，催化反应所需时间长。
技术实现思路
本专利技术提供了一株重组来源于真核生物赤拟谷盗L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的大肠杆菌，高密度发酵重组菌株，并用全细胞催化法生产β-丙氨酸。本专利技术的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，所述重组菌是异源表达了赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，以pET28a(+)为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD与表达载体连接，转入大肠杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pET28a(+)。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)扩增编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD；(2)将克隆出的基因连接到pET28a(+)，构建成为重组质粒pET28a-panD；(3)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21，筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD。本专利技术的第三个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是以L-天冬氨酸或L-天冬氨酸钠作为底物，利用所述重组大肠杆菌进行全细胞转化生产β-丙氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌经过高密度发酵，所述高密度发酵的条件为：将培养6-8h的重组大肠杆菌菌液按5-8％的接种量接种于含卡那霉素浓度为80-120μg/mL的2L发酵罐培养基中，35-38℃培养，当OD600达到70-75时，温度降至28-30℃，流加10-15％乳糖诱导，诱导培养35-40h结束发酵。在本专利技术的一种实施方式中，所述全细胞转化生产β-丙氨酸的体系：底物L-Asp-Na的浓度为600-1000mmol/L；其中，重组大肠杆菌浓度为OD600＝200-400；磷酸吡哆醛浓度为2-4mmol/L，40-60mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4缓冲液。本专利技术的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在医药、化工或食品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的L-天冬氨酸α-脱羧酶菌株，重组L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯酶比酶活为260U/mg；将重组菌株高密度发酵，以L-Asp-Na作为底物，进行全细胞催化反应制备β-丙氨酸。此法与化学生产法相比，生产工艺安全清洁，无环境污染，与酶法相比，底物价格便宜，催化效率高，终产物β-丙氨酸产率95％以上，简化产物的分离纯化步骤。附图说明图1：重组质粒pET28a-TcpanD的图谱；图2：TcpanD基因的PCR结果及重组质粒pET28a-TcpanD的双酶切结果；1：TcpanD扩增产物；2：重组质粒pET28a-TcpanD的BamHI和HindⅢ双酶切验证图3：TcpanD蛋白表达的SDS-PAGE验证结果；1：大肠杆菌BL21pET28a(+)对照菌的细胞破碎液上清；2：大肠杆菌BL21pET28a-TcpanD重组菌诱导后的细胞破碎液上清图4：全细胞催化生产β-丙氨酸示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做更详细的说明。发酵罐发酵培养基(g.L-1)：甘油8.0，工业级蛋白胨2.0，工业级酵母提取物2.0，一水合柠檬酸1.7，MgSO4.7H2O13.5，(NH4)2HPO44.0，KH2PO413.5，微量元素液10.0ml；其中微量元素液(g.L-1)：FeSO4.7H2O10，CuSO4.5H2O1.0，MnSO4·4H2O0.5,ZnSO4.7H2O2.3,CaCl22.0,Na2B4O7.10H2O0.2,(NH4)6Mo7O240.1，溶于1mol/LHCL中。补料培养基(g.L-1)：甘油500.0，工业级蛋白胨4.0，工业级酵母提取物4.0，MgSO4.7H2O7.4。天冬氨酸及β-丙氨酸含量的测定：反应液用苯基异硫酸酯(PITC)衍生，具体步骤为：取500μL反应液于2.0mL离心管，加入250μL0.1mol/LPITC乙腈溶液和250μL1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混匀，避光室温放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置30-60min，吸取下层溶液，经0.22μm有机滤膜过滤，进样量为10μL。衍生产物用HPLC测定：色谱柱为LaChromC18(5μm，4.6×250mm)；流动相A溶液为80％(V/V)乙腈水溶液，B溶液为97:3(V/V，pH6.5)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶液；采用梯度洗脱：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为40℃。实施例1重组大肠杆菌BL21/pET28a-TcpanD的构建根据丹麦科技大学惠赠的pCfB361(pESC-HIS3-TcpanD)重组质粒中TcpanD基因序列，通过密码子在线优化网站GraphicalCodonUsageAnalyser进行优化，基因片段由上海生工公司合成。优化后的TcpanD序列中不含酶切位点，设计特异性引物P1、P2(SEQIDNO.2、SEQIDNO.3划线部分分别为BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切位点)，并且在N端引入His标签。表1引物表P15'-CGCGGATCCATGCCAGCTACTGGTGAAGAT-3'P25'-CCCAAGCTTGTCACAAATCGGAACCCAATCT-3'将赤拟谷盗来源的编码L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD通过NdeⅠ和Hind本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是异源表达了赤拟谷盗来源的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶。

【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是异源表达了赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主。4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，以pET28a(+)为表达载体。5.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将编码氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基因panD与表达载体连接，转入大肠杆菌中。6.权利要求1所述大肠杆菌重组菌在生产β-丙氨酸中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以L-天冬氨酸或L-天冬氨酸钠作为底物，利用所述重组大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘中美，周丽，崔文璟，王超，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32