当前位置: 首页 > 专利查询>天津大学专利>正文

异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法技术

技术编号:17538006 阅读:58 留言:0更新日期:2018-03-24 11:49
本发明专利技术公开了一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法,步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌,消除质粒1,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,菌株1;将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯‑藿烯环化酶基因D377C SHC和巨大芽孢杆菌环化酶基因BmeTC连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C,得到质粒4;③将质粒4转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,菌株4;实验证明,异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵得到龙涎香醇。

Synthesis of heterologous recombinant Escherichia coli ambrein and its construction method

The invention discloses a heterologous recombinant Escherichia coli ambrein synthesis and its construction method, steps: 1 locus lacZ terminal 26 amino acid residues truncated C yeast squalene synthase gene ERG9 and Escherichia coli in the upstream and downstream homologous arm fusion donor DNA; plasmid DNA and plasmid donor 1; 1 together into Escherichia coli, plasmid elimination of 1 recombinant Escherichia coli, 1 strains of squalene synthesis; the mutation of 377th amino acid residues of cysteine residues after acid heat Alicyclobacillus hopenes squalene cyclase gene D377C SHC and Bacillus megaterium cyclase gene BmeTC connection a fragment inserted into Escherichia coli expression plasmid p5C, plasmid was 4; the 4 plasmid was transformed into strain 1, recombinant Escherichia coli, 4 strains of heterologous synthesis ambrein; experiments show that heterologous synthesis Fermentation of recombinant Escherichia coli ambrein obtained ambrein.

【技术实现步骤摘要】
异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
本专利技术涉及生物
,尤其涉及异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法。
技术介绍
龙涎香醇((+)-Ambrein)是一种三环三萜化合物,是名贵天然动物香料和传统中药龙涎香中的主要成分,是龙涎香香气的来源,同时也是发挥镇痛、抗炎等药效的活性成分。龙涎香醇一般在高端香水市场中被应用,由于其在自然界中十分难得,使龙涎香醇在香水工业和医药方面上的应用受到了制约。龙涎香醇最初由抹香鲸科动物抹香鲸(Physetermacrocephalus)的肠内分泌物龙涎香中分离所得,被认为是抹香鲸体内未完全消化食物而形成的一种病理性结石。龙涎香的获得有两种渠道,一是自抹香鲸体内排泄后,在海上漂浮,或被冲刷到海岸上为人们拾得。二是通过人工捕鲸所取得。自从1984年全世界禁止商业性捕鲸后,世上尚存的龙涎香已经少之又少。龙涎香醇的获得成为了行业难题,这使得龙涎香、龙涎香醇愈发地珍贵,人工拾得的天然龙涎香也远不能满足龙涎香醇在香水工业上的需求。Oritani等以法呢基乙酸和1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物,试图通过8步化学反应完成(+)-Ambrein的化学全合成。合成路径分为两个模块,第一个模块是以法呢基乙酸为底物合成二萜单元;第二个模块是以1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物合成单萜单元,最后通过格氏耦合反应(Grignardcoupling)将二萜和单萜单元连接在一起,形成龙涎香醇的三萜分子碳骨架。然而在关键的最后一步格式耦合反应中,单萜底物单元与二萜底物单元组合所形成的化合物出现了立体结构分化,除(+)-Ambrein之外,还产生(-)-Ambrein。Tanimoto等于1997年采用了与之前相同的合成路线,但在单萜底物单元的合成上实现了选择性的(1S)-(+)-2,2-二甲基-6-亚甲基-1-氯甲基环己烷合成,最终规避了其对映异构体(-)-Ambrein的形成,实现了龙涎香醇单一立体结构的合成。虽然化学合成龙涎香醇取得了一定进展,但是,化学合成方法非常复杂,收率很低,远远不能满足工业生产的要求。近年来,采用合成生物学技术异源合成了一些天然产物,但在微生物中异源合成龙涎香醇还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足,提供一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术的第二个目的是提供一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。本专利技术的第三个目的是提供上述异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的用途。本专利技术的第四个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术的第五个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。本专利技术的第六个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的用途。本专利技术的技术方案概述如下:异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC.47076的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC.47076中,通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQIDNO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.8所示;②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒4;所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC的核苷酸序列以SEQIDNO.2所示;所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQIDNO.3所示;所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.33所示;③将质粒4转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,命名为菌株4;所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.31所示。上述方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。上述异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵生产龙涎香醇的应用。第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因与大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC.47076的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC.47076中,通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因的核苷酸序列以SEQIDNO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.8所示;②将巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC和突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC通过融合PCR连接为一条片段BmeTC-Linker1-D377CSHC后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒5;所述BmeTC-Linker1-D377CSHC基因的核苷酸序列以SEQIDNO.4所示;所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.33所示;③将质粒5转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,命名为菌株5;所述质粒5的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.32所示。第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌菌株5。异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌菌株5发酵生产龙涎香醇的应用。本专利技术的优点:本专利技术成功构建了异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。实验证明,本专利技术的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵得到龙涎香醇。附图说明图1.质粒的遗传图谱。其中A为质粒1、B为质粒2、C为质粒3、D为质粒4、E为质粒5;图2.大肠杆菌胞内代谢产物的GC-MS分析。其中A为鲨烯标准品、B为菌株1、C为菌株2、D为菌株3、E为菌株4、F为菌株5、G为龙涎香醇标准品;H为鲨烯标准品质谱图、I菌株1胞内产物中检测到的鲨烯的质谱图、J为龙涎香醇标准品质谱图、K为菌株4胞内产物中检测到的龙涎香醇的质谱图、L为菌株5胞内产物中检测到的龙涎香醇的质谱图;图3.菌株4和菌株5中龙涎本文档来自技高网
...
异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法

【技术保护点】
异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中,通过CRISPR‑Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示;②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯‑藿烯环化酶基因D377CSHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl‑β‑curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒4;所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯‑藿烯环化酶基因D377C SHC的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示;所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl‑β‑curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示;所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.33所示;③将质粒4转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,命名为菌株4;所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.31所示。...

【技术特征摘要】
1.异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中,通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQIDNO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.8所示;②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒4;所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC的核苷酸序列以SEQIDNO.2所示;所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQIDNO.3所示;所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.33所示;③将质粒4转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,命名为菌株4;所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.31所示。2.权利要求1的方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。3....

【专利技术属性】
技术研发人员:卢文玉可迪
申请(专利权)人:天津大学
类型:发明
国别省市:天津,12

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1