The invention discloses a heterologous recombinant Escherichia coli ambrein synthesis and its construction method, steps: 1 locus lacZ terminal 26 amino acid residues truncated C yeast squalene synthase gene ERG9 and Escherichia coli in the upstream and downstream homologous arm fusion donor DNA; plasmid DNA and plasmid donor 1; 1 together into Escherichia coli, plasmid elimination of 1 recombinant Escherichia coli, 1 strains of squalene synthesis; the mutation of 377th amino acid residues of cysteine residues after acid heat Alicyclobacillus hopenes squalene cyclase gene D377C SHC and Bacillus megaterium cyclase gene BmeTC connection a fragment inserted into Escherichia coli expression plasmid p5C, plasmid was 4; the 4 plasmid was transformed into strain 1, recombinant Escherichia coli, 4 strains of heterologous synthesis ambrein; experiments show that heterologous synthesis Fermentation of recombinant Escherichia coli ambrein obtained ambrein.
【技术实现步骤摘要】
异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
本专利技术涉及生物
,尤其涉及异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法。
技术介绍
龙涎香醇((+)-Ambrein)是一种三环三萜化合物,是名贵天然动物香料和传统中药龙涎香中的主要成分,是龙涎香香气的来源,同时也是发挥镇痛、抗炎等药效的活性成分。龙涎香醇一般在高端香水市场中被应用,由于其在自然界中十分难得,使龙涎香醇在香水工业和医药方面上的应用受到了制约。龙涎香醇最初由抹香鲸科动物抹香鲸(Physetermacrocephalus)的肠内分泌物龙涎香中分离所得,被认为是抹香鲸体内未完全消化食物而形成的一种病理性结石。龙涎香的获得有两种渠道,一是自抹香鲸体内排泄后,在海上漂浮,或被冲刷到海岸上为人们拾得。二是通过人工捕鲸所取得。自从1984年全世界禁止商业性捕鲸后,世上尚存的龙涎香已经少之又少。龙涎香醇的获得成为了行业难题,这使得龙涎香、龙涎香醇愈发地珍贵,人工拾得的天然龙涎香也远不能满足龙涎香醇在香水工业上的需求。Oritani等以法呢基乙酸和1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物,试图通过8步化学反应完成(+)-Ambrein的化学全合成。合成路径分为两个模块,第一个模块是以法呢基乙酸为底物合成二萜单元;第二个模块是以1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物合成单萜单元,最后通过格氏耦合反应(Grignardcoupling)将二萜和单萜单元连接在一起,形成龙涎香醇的三萜分子碳骨架。然而在关键的最后一步格式耦合反应中,单萜底物单元与二萜底物单元组合所形成的化合物出现了立体结构分化,除(+)- ...
【技术保护点】
异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中,通过CRISPR‑Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示;②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯‑藿烯环化酶基因D377CSHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl‑β‑curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒4;所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸 ...
【技术特征摘要】
1.异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法,其特征是包括如下步骤:①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA;构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1;将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中,通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上,以阿拉伯糖诱导质粒1的消除,得到合成鲨烯的重组大肠杆菌,命名为菌株1;所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQIDNO.1所示;所述供体DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.28所示;所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.8所示;②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点,得到质粒4;所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377CSHC的核苷酸序列以SEQIDNO.2所示;所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQIDNO.3所示;所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.33所示;③将质粒4转化入菌株1,得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌,命名为菌株4;所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQIDNO.31所示。2.权利要求1的方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。3....
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