核壳结构复合材料的制备及利用其构建组织工程微组织的方法技术

本发明专利技术提供一种核壳结构复合材料的制备及利用其构建组织工程微组织的方法。其具体是采购新鲜宰杀的大型哺乳动物的四肢骨依次进行脱钙、脱脂、脱蛋白后粉碎得到的骨颗粒再次进行脱脂、脱钙及脱蛋白处理得到脱钙骨DBM微颗粒；将明胶粉末添加到PBS缓冲液中配置成明胶溶液，然后明胶溶液涂抹到PDMS板上的微孔中，并在每个孔中加入2‑5粒DBM颗粒，再经过交联、冲洗和冻干后得到核壳结构复合材料；使用顶针将其顶出来，然后聚集成团并置于培养皿中，将配制的细胞悬液滴加到核壳结构复合材料上进行培养得到组织工程微组织。本发明专利技术制备的核壳结构材料既具有明胶的良好生物相容性，也具有脱钙骨基质的良好力学特性，在植入体内以后，有利于血管长入。

Preparation and use of nuclear shell composite materials to construct tissue engineering microstructures

The invention provides a preparation of a core - shell composite material and a method for the construction of a tissue engineering microtissue. The large mammals slaughtered the fresh bone in decalcification, defatting and deproteinization after crushing bone particles obtained again degreasing and decalcification and deproteinization by decalcified bone DBM micro particles; the gelatin powder is added to the PBS buffer configuration into gelatin solution, and gelatin solution onto microporous PDMS on the board, and in each hole with 2 5 DBM particle, then the core-shell structure composite material obtained by crosslinking, rinse and freeze-dried; use the thimble top out, then aggregated and placed in a Petri dish, the preparation of the cell suspension was dripped into the core-shell structure composite materials were cultured on tissue engineering by micro tissue. The core-shell structure material prepared by the invention not only has good biocompatibility of gelatin, but also has good mechanical properties of demineralized bone matrix. After implantation, it is favorable for blood vessel ingrowth.

【技术实现步骤摘要】
核壳结构复合材料的制备及利用其构建组织工程微组织的方法
本专利技术涉及生物移植及构建，具体是一种核壳结构复合材料的制备方法，以及利用该核壳结构复合材料构建骨组织工程微组织的方法。
技术介绍
基于创伤或其他原因所导致的大段骨缺损是临床上的一大难题，与传统修复方法(自体骨，生物材料填充等)相比，以间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)为核心的骨组织工程移植物(tissueengineeringbonegraft,TEBG)具有成骨活性好，创伤小，来源广，免疫原性低等优点，是一种较有潜力的治疗方式。但是，传统组织工程的构建过程存在两方面不足：(1)种子细胞首先需要在二维条件下进行平面扩增，这与体内三维生长环境不同，一定程度可能会影响细胞的代谢及再生潜能，此外传代中的反复胰酶消化也可能破坏细胞外基质影响干细胞的分化潜能；(2)构建方式是采用自上而下(Top-down)方式将种子细胞直接种植在三维多孔材料表面，由于材料孔径孔隙不均一、营养代谢交换不畅等原因，在构建大尺寸复杂微结构组织时种子细胞往往分布不均匀，进而导致体内修复效果参差不齐。为了解决这一问题，人们研究出了组织工程微组织(tissueengineeredmicrotissue,TEMT)策略，其主要优势是：1)利用微流体、微孔阵列、微载体等微尺度技术，构建出模块化的三维结构组织工程微单元，使得种子细胞可在与体内细胞外基质相似的水凝胶等材料上进行三维扩增，或自组装形成细胞微球，从而模拟体内三维生长环境，保护细胞干性进而提高再生效率；2)可利用自下而上(Bottom-up)的方式将微单元利用模具约束法、磁力辅助组装、静电作用力组装、细胞打印等方法进行组装，构建出细胞均一分布的复杂微结构大块组织，模块间较均匀的孔隙也可能更有利于血管长入及营养交换，提高成骨效率。但无论是水凝胶或是细胞微球，在骨再生材料所需的力学弹性及骨诱导活性等方面均有所不足。核壳结构材料是指通过化学键或其他方式包裹形成的复合材料，具有中心的核体及包裹的壳层。因此与单一材料相比，它可以整合内外两种材料的性质，并互相补充各自的不足。核壳结构材料组成繁多，可以用任意种类材料制备，金属、绝缘、半导体等均可作为核体，目前在新能源领域，生物医药等方面有广泛的应用前景，在骨再生领域也有部分研究报道，如SuY等使用胶原/PLLACL制备了可缓释BMP2及地塞米松的组织工程用核壳结构纳米电纺丝；YongxiangLuo报道使用藻酸盐/纳米羟基磷灰石颗粒构建了一种可用于体内生物矿化的核壳结构材料等等。但还未见相关文献报道将其应用在组织工程微组织的构建领域。
技术实现思路
本专利技术是针对现有技术的不足提供一种基于明胶-脱钙骨基质(demineralizedbonematrix,DBM)的核壳结构复合材料的制备及利用其构建组织工程微组织的方法，所述方法构建的明胶-DBM核壳结构组织工程微组织可利用DBM的良好力学特性及骨传导特性，提高微组织的骨再生性能。本专利技术提供的技术方案：所述一种核壳结构复合材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)DBM内核材料的制备：a.市场采购新鲜宰杀的大型哺乳动物的四肢骨,选取粗大股骨远端及股骨头部分锯下截成3-5cm3大小块状骨；b.将步骤a中的块状骨置于浓度为0.6mol/L的稀盐酸中浸泡至大头针可扎入骨骺端为止，并剥去软骨层暴露松质骨，进行脱钙处理；c.按甲醇：98％丙酮＝1:1比例配制脱脂液，然后将步骤b中脱钙处理后的骨块置于配制好的脱脂液中浸泡48h以上，再将骨块取出放入浓度为3％的过氧化氢溶液中浸泡1小时以上，完成骨块的脱脂处理；d.将浓度为2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液和8mol/L的LiCl溶液按照按1:1:1比例配制脱蛋白液，将步骤c中脱脂处理后的骨块浸泡到配制好的脱蛋白液中，在温度为4℃的条件下浸泡16-24小时后，取出骨块用流水清洗多次洗掉骨块上的残留液体，之后置于-70-85℃的低温条件下进行预冻12-24h；e.将步骤d中预冻后的骨块取出，对其进行冷冻干燥和灭菌处理后，再置于-80℃条件下冷冻40-60h，然后在液氮中进行冷冻粉碎，并确保粉碎温度在0℃以下，粉碎完成后通过筛分选取粒径为200-500μm之间的骨颗粒；f.将步骤e中得到的200-500μm之间的颗粒重复步骤b至d进行脱脂、脱钙及脱蛋白处理得到脱钙骨DBM微颗粒，并对DBM微颗粒依次进行冷冻干燥、灭菌处理在4℃无菌条件下保存；(2)明胶溶液的配制：将明胶粉末添加到PBS(磷酸缓冲盐溶液)中配置成明胶浓度为3％-10％的明胶溶液，并在4℃条件下放置3-6小时去除泡沫；(3)核壳结构复合材料的制备：取0.5-0.8mm厚的PDMS(聚二甲基硅氧烷)板，采用激光打孔机于板上制备若干个直径为800-2000μm的孔，将步骤(2)中配制的明胶浓度为3％-10％明胶溶液利用盖玻片均匀涂抹到PDMS板上的孔中，然后将步骤(1)中制备的DBM颗粒均匀铺至每个填充有明胶溶液的孔中，每个孔中放置2-5粒DBM颗粒，将其预冻使明胶溶液变成固体后，将含有冻干明胶和DBM颗粒的PDMS板浸泡于0.3％的戊二醛溶液，交联0.5-2小时后，清洗去掉交联液后再次预冻凝固后，置于冷冻干燥机中在-60℃条件下冷冻干燥1-3h在每个孔中形成单颗核壳结构复合材料；(4)使用顶针将PDMS板每个孔中的核壳结构复合材料顶出来，便采用去离子水对其进行冲洗后，冷冻干燥形成粒径为800-2000μm的颗粒状核壳结构复合材料。本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)中的大型哺乳动物为牛或羊或猪。本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)的e步骤中的冷冻干燥时间为12-24h，冷冻干燥后采用60Co辐射或者环氧乙烷灭菌，冷冻粉碎后分别使用200μm和500μm的筛网对粉碎颗粒进行筛选选取粒径为200-500um之间的骨颗粒。本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)的f步骤中脱钙骨DBM微颗粒冷冻干燥时间为8-12h,之后采用环氧乙烷进行灭菌处理。本专利技术较优的技术方案：所述步骤(3)中将加入DBM颗粒的明胶溶液在-20℃条件下预冻16-24h后，置于冷冻干燥机中在-60℃条件下冷冻干燥1-3h，随后将含有冻干明胶和DBM颗粒的PDMS板浸泡于0.3％的戊二醛溶液，交联0.5-2小时后，清洗去掉交联液后再次预冻凝固后，置于冷冻干燥机中在-60℃条件下冷冻干燥1-3h在每个孔中形成单颗核壳结构复合材料。本专利技术较优的技术方案：所述步骤(4)中的顶针是用3D打印得到的750-1300μm的光敏树脂顶针，采用顶针从PDMS板每个孔中顶出的核壳结构复合材料采用去离子水冲洗后，先在-20℃条件下再次预冻16-24h后置于冷冻干燥机在-60℃条件下冷冻干燥1-3h形成颗粒状核壳结构复合材料。本专利技术提供的一种利用核壳结构复合材料构建组织工程微组织的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)取50粒上述颗粒状核壳结构复合材料，聚集成团并置于培养皿中，然后将间充质干细胞的P3-P5代细胞配制成(1～5)×106/ml的细胞悬液，并将配制的细胞悬液按照(50～70)μl/50粒核壳结构复合材料的量滴加到聚集成团的颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核壳结构复合材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)DBM内核材料的制备：a.市场采购新鲜宰杀的大型哺乳动物的四肢骨,选取粗大股骨远端及股骨头部分锯下截成3‑5cm

【技术特征摘要】
1.一种核壳结构复合材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)DBM内核材料的制备：a.市场采购新鲜宰杀的大型哺乳动物的四肢骨,选取粗大股骨远端及股骨头部分锯下截成3-5cm3大小块状骨；b.将步骤a中的块状骨置于浓度为0.6mol/L的稀盐酸中浸泡至大头针可扎入骨骺端为止，并剥去软骨层暴露松质骨，进行脱钙处理；c.按甲醇：98％丙酮＝1:1比例配制脱脂液，然后将步骤b中脱钙处理后的骨块置于配制好的脱脂液中浸泡48h以上，再将骨块取出放入浓度为3％的过氧化氢溶液中浸泡1小时以上，完成骨块的脱脂处理；d.将浓度为2mol/L的CaCl2溶液、0.5mol/L的EDTA溶液和8mol/L的LiCl溶液按照按1:1:1比例配制脱蛋白液，将步骤c中脱脂处理后的骨块浸泡到配制好的脱蛋白液中，在温度为4℃的条件下浸泡16-24小时后，取出骨块用流水清洗多次洗掉骨块上的残留液体，之后置于-70-85℃的低温条件下进行预冻12-24h；e.将步骤d中预冻后的骨块取出，对其进行冷冻干燥和灭菌处理后，再置于-80℃条件下冷冻40-60h，然后在液氮中进行冷冻粉碎，并确保粉碎温度在0℃以下，粉碎完成后通过筛分选取粒径为200-500μm之间的骨颗粒；f.将步骤e中得到的200-500μm之间的颗粒重复步骤b至d进行脱脂、脱钙及脱蛋白处理得到脱钙骨DBM微颗粒，并对DBM微颗粒依次进行冷冻干燥、灭菌处理在4℃无菌条件下保存；(2)明胶溶液的配制：将明胶粉末添加到PBS缓冲液中配置成明胶浓度为3％-10％的明胶溶液，并在4℃条件下放置3-6小时去除泡沫；(3)核壳结构复合材料的制备：取0.5-0.8mm厚的PDMS板，采用激光打孔机于板上制备若干个直径为800-2000μm的孔，将步骤(2)中配制的明胶浓度为3％-10％明胶溶液利用盖玻片均匀涂抹到PDMS板上的孔中，然后将步骤(1)中制备的DBM颗粒均匀铺至每个填充有明胶溶液的孔中，每个孔中放置2-5粒DBM颗粒，将其预冻使明胶溶液变成固体后，将含有冻干明胶和DBM颗粒的PDMS板浸泡于0.3％的戊二醛溶液，交联0.5-2小时后，清洗去掉交联液后再次预冻凝固后，置于冷冻干燥机中在-60℃条件下冷冻干燥1-3h在每个孔中形成单颗核壳结构复合材料；(4)使用顶针将PDMS板每个孔中的核壳结构复合材料顶出来，便采用去离子水对其进行冲洗后，冷冻干燥形成粒径为800-2000μm的颗粒状核壳结构复合材料。2.根据权利要求1所述的一种核壳结构复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的大型哺乳动物为牛或羊或猪。3.根据权利要求1所述的一种核壳结构复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的e步骤中的冷冻粉碎时间为12-24h，冷冻粉碎后采用60Co辐射或者环氧乙烷灭菌，冷冻粉碎后分别使用200μm和500μm的筛网对粉碎颗粒进行筛选选取粒径为200-500um之间的骨颗粒。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：罗超，汪振星，孙家明，方慧敏，吴顺，陈雳风，李嘉伦，周楚超，周牧冉，刘邵恺，曾宇阳，张馨月，牟珊，黎媛，侯金飞，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42