一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法。所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的I反应液，检测花生根结线虫的A反应液，检测爪哇根结线虫的J反应液，Bst DNA聚合酶大片段和100×SYBR Green I染色液；本发明专利技术基于环介导等温扩增技术，对检测条件的要求低，只需水浴锅或恒温箱就能实现检测，利于推广应用。本发明专利技术包含的试剂盒及方法由于不需要进行凝胶电泳，肉眼可以直接观察检测结果，因而耗时短，1.5h可以完成检测，本发明专利技术试剂盒包含了用于南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫检测LAMP检测的引物，可以同步对烟草根结线虫病常见的三种病原根结线虫进行检测。

A detection kit for pathogen detection of tobacco root knot nematode and its use method based on loop mediated isothermal amplification

The invention discloses a pathogen detection kit for tobacco root knot nematode and the use method based on the ring mediated isothermal amplification technology. The tobacco root loop mediated isothermal amplification technology node nematode disease detection kit for I reaction liquid meloidogyneincognita detection based on the detection of A reaction solution of peanut root knot nematode, detection of J reaction liquid of Meloidogyne javanica, Bst DNA polymerase large fragment and 100 * SYBR Green I staining solution; the invention of loop mediated isothermal amplification technique based on the detection conditions of low, only water bath or incubators can detect, for application. The kit and the method of the invention contains as the need for gel electrophoresis, the naked eye can directly observe the test results, so the short time, 1.5h can complete the detection kit of the invention comprises the root knot nematode, Hua Shenggen knot nematode Meloidogyne javanica and LAMP detection primers, three kinds of root knot nematode the synchronization of tobacco root knot nematode disease common detection.

【技术实现步骤摘要】
一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法
本专利技术属于植物病害病原检测
，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
烟草根结线虫病是一种严重影响烟草生产的土传性病害。近年来，用于根结线虫病防治的多数化学杀线虫剂存在高毒、高残留的弊端，已在世界范围内被普遍禁用。因此采取安全高效的根结线虫病防控方法已成为大势所趋。在烟草根结线虫病的防控过程中，选择采用合适的抗病烟草品种被认为是一项经济、高效、绿色的措施。然而，根结线虫种类繁多，不同根结线虫对寄主植物的致病能力不同，抗病品种对根结线虫的抗性范围也有限，当前国内烟草上分布最广泛危害最严重的根结线虫主要是花生根结线虫（Meloidogynearenaria）、南方根结线虫（M.incognita）和爪哇根结线虫（M.javanica），这三种根结线虫的形态和分子生物学特征极为相似，但对不同烟草品种存在较大的致病性差异。因此准确、快速鉴定上述三种根结线虫是选育和利用抗病烟草品种的前提条件。鉴定根结线虫种类最常用的方法是形态学方法，该方法通过显微操作方法切割根结线虫雌成虫会阴区角质膜，在显微镜下观察会阴区花纹的差异来确定根结线虫的种类。这种方法的优点是简便、直观，存在的弊端是：1.根结线虫种类多，许多种类的会阴花纹特点比较容易混淆，使得鉴定的准确性完全依靠操作者的经验，误判的概率较高；2.同一种类的根结线虫的会阴花纹存在个体差异，在实际操作时至少需要对20头以上的雌成虫进行观察才能确诊，费工、费时；3.形态学鉴定只适用于成虫，不适宜幼虫，而土壤中分离到的根结线虫都是以二龄幼虫的形式存在，使的该方法在实际应用中受到限制。另外，同工酶电泳方法也是根结线虫鉴定中常用的方法，该方法以根结线虫雌成虫的蛋白粗提物进行聚丙烯酰胺电泳，通过酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶染色后根据酶带的谱型来进行种类判断，该方法部分克服了形态学鉴定的缺点，可以比较快速准确的判断根结线虫种类，但依然只能用雌成虫来作为鉴定对象。近年来随着分子生物学技术的发展，采用PCR技术对根结线虫进行快速、准确鉴定已成为趋势。与形态学和同工酶电泳鉴定方法相比，PCR鉴定法适用范围更为广阔，根结线虫的卵、二龄幼虫和雌雄成虫皆可作为鉴定的对象。早期的PCR鉴定包括采用随机引物扩增的RAPD－PCR技术或采用线虫通用引物扩增后再对扩增产物进行限制性酶切的PCR－RFLP技术，它们的共同缺点是由于使用非根结线虫专用的特异引物而造成鉴定的稳定性和准确性不高。因此，国内外学者近年来开始转而采用根结线虫种类特异性PCR引物扩增来进行根结线虫的种类鉴定。徐建华等专利技术的《一种根结线虫快速分子检测引物及其用法》（专利号：ZL03131763.4），曾建敏等专利技术的《一种烟草中根结线虫的鉴定方法》（专利号：ZL201610585565.X）提供了烟草根结线虫病病原线虫PCR鉴定的新方法，该方法采用三对根结线虫种类特异引物对分离自烟草病根和土壤的根结线虫分别进行PCR检测，鉴定方便，准确率高，大大提高了烟草根结线虫病病原的诊断效率。但由于采用了常规PCR检测法，使得鉴定过程操作繁琐、耗时长，且需要较为昂贵的仪器设备。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒；第二目的在于提供所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒的使用方法。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的I反应液，检测花生根结线虫的A反应液，检测爪哇根结线虫的J反应液，BstDNA聚合酶大片段和100×SYBRGreenI染色液；其中，I反应液的溶质及其浓度为：引物MiF3和MiB3各0.2μmol·L-1，引物MiFIP和MiBIP各1.6μmol·L-1，dNTPs（2.4mmol·L-1），Tris-HCl（20mmol·L-1，pH8.8），KCl（10mmol·L-1），MgSO4（6.0mmol·L-1），(NH4)2SO4（10mmol·L-1），0.1%Tritonx-100；MiF3：5'-GTGCTTCGTCTTTTGCTT-3'；MiB3：5'-ACTTTCCTTGGAATTGGAACA-3'；MiFIP：5'-AGGAAGGTATACTATCCAAGACCCA-TTTAAAATCTGTTTCGGCACAC-3'；MiBIP：5'-TTCACAAAAAACCCAATATGTCAGC-CGATATCTAGGGGTGTTTGA-3'；A反应液的溶质及其浓度为：引物MaF3和MaB3各0.2μmol·L-1，引物MaFIP和MaBIP各1.6μmol·L-1，dNTPs（2.4mmol·L-1），Tris-HCl（20mmol·L-1，pH8.8），KCl（10mmol·L-1），MgSO4（6.0mmol·L-1），(NH4)2SO4（10mmol·L-1），0.1%Tritonx-100；MaF3：5'-TGCTTTCAACGCGGTATG-3'；MaB3：5'-ATTTCTCTCCACGAGTTTCT-3'；MaFIP：5'-CCACTTTGCCTCAGCGAAATTT-GTCGTAATCAATGGGTTGTC-3'；MaBIP：5'-GTGGCTTTTCGATGTTCGCT-TAGCCCAATTTGAGTTTTCC-3'；J反应的溶质及其浓度为：引物MjF3和MjB3各0.2μmol·L-1，引物MjFIP和MjBIP各1.6μmol·L-1，dNTPs（2.4mmol·L-1），Tris-HCl（20mmol·L-1，pH8.8），KCl（10mmol·L-1），MgSO4（6.0mmol·L-1），(NH4)2SO4（10mmol·L-1），0.1%Tritonx-100；MjF3：5'-TCGGAAATGACGAAGGTG-3'；MjB3：5'-TTATAAACCCAGCTAGGGAC-3'；MjFIP：5'-TTAGGCTGATTTCCGATTTCCGAC-TCGGAAATGGGAACTGTC-3'；MjBIP：5'-ATGTCGGAAATCGGAATTCCAG-CCCCATTTATTCGCAAGAC-3'。本专利技术的第二目的是这样实现的，是将含有待测烟草根结线虫病原线虫的DNA提取液，分别加入烟草根结线虫病病原线虫LAMP检测的试剂盒所包含的I反应液、A反应液和J反应液中，在BstDNA聚合酶大片段的作用下进行环介导等温扩增，然后进行SYBRGreenⅠ染色，可见光或紫外光下观察，如果I反应液呈现绿色表示待测样品含有南方根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含南方根结线虫；如果A反应液呈现绿色表示待测样品含有花生根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含花生根结线虫；如果J反应液呈现绿色表示待测样品含有爪哇根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含爪哇根结线虫。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒，其特征在于所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的I反应液，检测花生根结线虫的A反应液，检测爪哇根结线虫的J反应液，Bst DNA聚合酶大片段和100×SYBR Green I染色液；其中， I反应液的溶质及其浓度为：引物MiF3和MiB3各0.2μmol·L

【技术特征摘要】
1.一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒，其特征在于所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的I反应液，检测花生根结线虫的A反应液，检测爪哇根结线虫的J反应液，BstDNA聚合酶大片段和100×SYBRGreenI染色液；其中，I反应液的溶质及其浓度为：引物MiF3和MiB3各0.2μmol·L-1，引物MiFIP和MiBIP各1.6μmol·L-1，dNTPs（2.4mmol·L-1），Tris-HCl（20mmol·L-1，pH8.8），KCl（10mmol·L-1），MgSO4（6.0mmol·L-1），(NH4)2SO4（10mmol·L-1），0.1%Tritonx-100；MiF3：5'-GTGCTTCGTCTTTTGCTT-3'；MiB3：5'-ACTTTCCTTGGAATTGGAACA-3'；MiFIP：5'-AGGAAGGTATACTATCCAAGACCCA-TTTAAAATCTGTTTCGGCACAC-3'；MiBIP：5'-TTCACAAAAAACCCAATATGTCAGC-CGATATCTAGGGGTGTTTGA-3'；A反应液的溶质及其浓度为：引物MaF3和MaB3各0.2μmol·L-1，引物MaFIP和MaBIP各1.6μmol·L-1，dNTPs（2.4mmol·L-1），Tris-HCl（20mmol·L-1，pH8.8），KCl（10mmol·L-1），MgSO4（6.0mmol·L-1），(NH4)2SO4（10mmol·L-1），0.1%Tritonx-100；MaF3：5'-TGCTTTCAACGCGGTATG-3'；MaB3：5'-ATTTCTCTCCACGAGTTTCT-3'；MaFIP：5'-CCACTTTGCCTCAGCGAAATTT-GTCGTAATCAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梅云，李文正，吴文涛，高玉龙，吴兴富，宋中邦，薛美静，王丙武，王扬，焦芳婵，曾建敏，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53