一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，该工艺采用补料分批发酵，过程包括：细胞快繁阶段：将菌种接种至基础发酵培养基；温度为30～37℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.2～0.5；产酶阶段：细胞浓度达到OD600＝70～90时，加入乳糖诱导工程菌产酶，直至发酵结束；培养温度为15～25℃，溶氧量为5～75％，pH值为6.8～7.2；工程菌比生长速率为0.01～0.1。本发明专利技术工艺将补料分批发酵人为分成两个阶段并控制各阶段的培养条件，使得重组腈水合酶基因工程菌实现高密度发酵，不仅提高了产腈水合酶的工程菌的菌浓度，还提高了腈水合酶的酶活。

A high density fermentation process for recombinant bacillus coli gene engineered by recombinant nitrile hydratase

【技术实现步骤摘要】
一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺
本专利技术属于发酵工程
，尤其涉及一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺。
技术介绍
腈水合酶(EC4.2.1.84)是一类广泛存在于自然界的微生物酶(迄今已报道的腈水合酶几乎全部来源于细菌)，催化腈化合物生成相应的酰胺，腈水合酶的发现和应用是工业生物
中的经典代表作之一，具有化学催化剂无法比拟的优势，从而被广泛应用于酰胺化学品的合成中。腈水合酶最早被用于催化丙烯腈生产丙烯酰胺，日本是生物法合成丙烯酰胺技术的最早实践和拥有者，而且生产工艺技术也最为先进。历经三次菌种革新，由三代菌种R.rhodochrousJ1，实现了生产丙烯酰胺的能力由4000吨/年提升到20000吨/年(NagasawaT.ShimizuH.YamadaH.Thesuperiorityofthethird-generationcatalyst,RhodococcusrhodochrousJ1nitrilehydratase,forindustrialproductionofacrylamide[J].Appl.Microbiol.Biotechnol.1993,40:189-195)。我国从上世纪80年开始进行微生物生产丙烯酰胺的研究，已取得了重大突破。上海农药研究所沈寅初院士课题组从泰山的土壤中发现了腈水合酶菌株Nocardiasp.86-163，和日本RhodococcusRhodochrousJ1的产酶水平基本上处于同一高度(张云桦，方仁萍，沈寅初.一株产丙烯腈水合酶菌株的的研究[J].工业微生物，1998,28:1-5)(沈寅初，张国凡，韩建生.微生物生产丙烯酰胺[J].工业微生物，1994,24:24-32)。生物催化法生产烟酰胺是腈水合酶应用的另一大实例，瑞士龙沙(Lonza)集团已在我国广州南沙市建立一条年产9000吨的烟酰胺生产线，采用R.RhodochrousJ1全细胞作为催化剂，应用细胞固定化技术进行生产。目前，应用于工业化生产的腈水合酶都是通过野生菌来表达、用野生菌细胞进行发酵生产。但野生菌发酵周期长、产酶质量不稳定。随着生物技术的迅猛发展，采用分子克隆构建腈水合酶基因工程菌，有望解决上述实际问题。重组异源蛋白的工业化生产，除了需要构建出高效稳定表达外源基因产物的工程菌外，大规模培养工程菌的技术和工艺显得日趋重要。因为，在工程菌的大规模发酵过程中，重组异源蛋白产物的产量取决于外源基因的表达水平以及菌体密度。在外源基因表达水平不变的前提下，提高工程菌的发酵密度可以大幅度提高产量，降低成本。但目前，工业化应用的产腈水合酶的微生物都是经过低密度发酵获得的，一般菌体密度(以干重计)在10g/L以下，这导致生产腈水合酶的设备投资大、效率低下、成本高昂。
技术实现思路
本专利技术提供了一种全新的高密度发酵工艺，特别适用于重组腈水合酶基因工程菌的大规模生产，该发酵工艺可显著提高基因工程菌的浓度和重组腈水合酶的酶活力。具体技术方案如下：一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，所述补料分批发酵的过程包括：(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH4Cl和0.6g/LMgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。具体的，本专利技术以两种菌株为例，即：表达博得特氏菌DSM12804(BordetellapetriiDSM12804)来源腈水合酶的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP；以及表达锰氧化橙单胞菌SI859A(AurantimonasmanganoxydansSI859A)来源腈水合酶的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-pENHase-1229。上述重组腈水合酶基因工程菌中的重组腈水合酶分别来源于博得特氏菌(Bordetellapetrii)DSM12804和锰氧化橙单胞菌(Aurantimonasmanganoxydans)SI859A；重组腈水合酶基因的碱基序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，工程菌采用大肠杆菌E.coliBL21(DE3)作为宿主菌，以pET-30a(+)作为载体。本专利技术工艺所涉及的腈水合酶是在大肠杆菌中表达的胞内酶，为了高效、大规模地获取表达腈水合酶的大肠杆菌细胞，同时利用基因工程菌具有精确的基因开关的特点，我们将发酵过程分为两个阶段、分别加以控制：即细胞快繁阶段和产酶阶段。其中，在细胞快繁阶段，采用指数流加方式连续补加补料培养基，使基因工程菌以一恒定的比生长速率快速生长；而在产酶阶段，采用恒速流加的方式继续连续补加补料培养基，使基因工程菌的主要生理代谢活动适合腈水合酶的高效表达，这一阶段菌体快速生长和繁殖虽然较为缓慢、但并未停止，从而进一步提高发酵密度。大肠杆菌发酵最适温度是37℃，最适pH6.8～7.2，当条件最适菌体生长时，大肠杆菌很快就会进入指数生长期。当基础培养基营养物质被耗尽后，生长进入衰亡期，但如果在基础培养基营养物质被耗尽前流加营养物质(补料培养基)，大肠杆菌的指数生长期会大大延长，从而获得高细胞密度。然而，随温度上升细菌代谢加快，其产生代谢副产物也会增加，这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度，菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降，但同时也减少了有毒代谢副产物的产生和代谢热的产生。因此，降低温度、降低比生长速率，更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同，为了能获得大量的目的蛋白，首先要保证菌体的量，因此在前期可优先考虑菌体的生长，到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。作为优选，步骤(1)中，所述温度为32～35℃，溶氧量为20～30％；步骤(2)中，所述温度为18～20℃，溶氧量为30～50％。作为优选，步骤(1)中，控制所述基因工程菌的比生长速率为0.2～0.3；步骤(2)中，控制所述基因工程菌的比生长速率0.01～0.04。作为优选，步骤(1)中，以基础发酵培养基的体积计，所述基因工程菌菌种的接种量为5～15％。作为优选，步骤(2)中，以发酵液的体积计，所述乳糖的投加量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，所述补料分批发酵的过程包括：(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/L Na2HPO4·12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl和0.6g/L MgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。...

【技术特征摘要】
1.一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺，包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵，其特征在于，所述补料分批发酵的过程包括：(1)细胞快繁阶段：将种子培养后的重组腈水合酶基因工程菌菌种接种至基础发酵培养基中进行培养；其中，培养的温度为30～37℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间；(2)产酶阶段：待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD600＝70～90时，向发酵液中加入乳糖诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束；其中，培养的温度为15～25℃，发酵液的溶氧量为5～75％，发酵液的pH值为6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.01～0.1之间；所述基础发酵培养基为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母抽提物，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3.0g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH4Cl和0.6g/LMgSO4，卡那霉素浓度为50μg/mL；所述补料培养基为：300～600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。2.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，表达所述重组腈水合酶的基因工程菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。3.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，所述温度为32～35℃，溶氧量为20～30％；步骤(2)中，所述温度为18～20℃，溶氧量为30～50％。4.如权利要求1所述的高密度发酵工艺，其特征在于，步骤(1)中，控制所述基因工程菌的比生...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨立荣，周海胜，张红玉，吴坚平，徐刚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33