一种Ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种Ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用。所述伪狂犬病毒减毒株，为gE

A type II pseudorabies virus strain and its preparation and Application

The invention discloses a type II pseudorabies virus strain and the preparation method and application of the type II pseudorabies virus strain. The pseudorabies virus strain, gE

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种Ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。已经给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前，有很多欧洲国家宣布通过接种疫苗并结合相关的血清学诊断技术根除了伪狂犬病。我国也通过疫苗接种有效控制了伪狂犬病的流行趋势。但是，2011年来，在中国暴发流行了一种免疫过伪狂犬病疫苗的猪伪狂犬病。伪狂犬病毒是一种病毒粒子为圆形、直径150～180nm带有囊膜的疱疹病毒(Herpesviridae)。其核衣壳主要由UL19基因、UL35基因编码的蛋白构成，核衣壳与囊膜之间存在被膜蛋白，至少有14种蛋白来自病毒基因组编码。已确定蛋白质功能的有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN等11种糖蛋白，gB、gD、gH、gL是病毒体外复制和感染所必需的糖蛋白，与PRV的神经传导有关；gC、gE、gG和gM是病毒复制的非必需糖蛋白，其中gC、gE与gI与PRV在神经细胞间的传导方向有关。PRV的毒力受到多个基因的联合控制，与其毒力有关的基因有UL区的UL10、UL13、UL21、UL23(TK)、UL39/40、UL44、UL50，US区的US3(PK)、US7、US8。其中TK或PK的缺失能导致病毒毒力的显著下降。gE基因是US8基因的编码产物，是病毒囊膜中发现的六个结构蛋白之一。gE是一种能促进细胞融合的糖蛋白，促进病毒感染细胞与临近正常细胞的融合，参与了病毒在细胞间的传播和PRV病毒粒子的释放。已经有大量研究表明，gE的缺失虽然不会显著影响病毒的LD50，但是能降低病毒的嗜神经性且不影响其免疫原性。TK基因位于UL23区，全长约900bp，编码297个氨基酸，是疱疹病毒的一个主要毒力基因。TK不是PRV生长所必须基因，但对PRV在宿主神经组织细胞中的增殖、复制、潜伏感染及复活却起到关键作用，主要参与PRV的复制和潜伏感染。TK缺失可以使PRV对猪和反刍动物的毒力大大降低。有研究显示，用缺失TK的毒株免疫小鼠后可以抵抗亲本毒102-103倍致死剂量的攻击，TK的缺失也是基因缺失苗的重点研究对象。由于伪狂犬病尚无有效的治疗药物，疫苗的免疫接种便成了预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。现在应用比较广泛的是用伪狂犬病毒经典毒株BarthaK61和BUK株制成的疫苗。BarthaK61株是由Bartha株在异源细胞中反复传代获得的。BUK则是将弱毒株Bucharest株通过鸡胚和鸡胚成纤维细胞继续传代800代以后才获得的，对妊娠母猪和仔猪都有一定的免疫保护作用。基因缺失疫苗是指利用基因工程技术，缺失PRV基因组中与毒力相关的基因整体或片段，从而获得的基因缺失疫苗。缺失苗的优点在于缺失位点明确，不易发生毒力回复，可用于疫苗株与野毒株的鉴别区分，被称为血清学“标志”疫苗，是根除伪狂犬病的关键。目前，很多国家都研制出了伪狂犬病毒经典毒株的基因缺失苗，在伪狂犬病的预防、控制及根除中发挥了重要作用。
技术实现思路
本专利技术分离鉴定出一株新的伪狂犬病毒毒株，在该毒株的基础上进行基因工程改造获得了一株gE/TK两基因缺失的伪狂犬病毒减毒株。一种伪狂犬病毒减毒株，为gE-/TK-双缺毒株，命名为猪伪狂犬病病毒双缺株，株号PRV-HD/c，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.14325，保藏时间为：2017年7月6日。本专利技术又提供了所述的伪狂犬病毒减毒株的制备方法，包括以下步骤：(1)分离鉴定野生型伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCCNo.14326；(2)敲除猪伪狂犬病病毒PRV-DX毒株基因组中的gE和TK两个基因后通过病毒拯救获得所述伪狂犬病毒减毒株。所述的制备方法，基因敲除的方法为采用Cre-LoxP重组系统分两步依次敲除gE和TK两个基因。本专利技术又提供了所述的伪狂犬病毒减毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。所述伪狂犬病疫苗的接种对象为猪伪狂犬病毒易感动物。所述伪狂犬病毒易感动物为猪或小鼠。本专利技术还提供了一种伪狂犬病疫苗，包含灭活后的所述伪狂犬病毒减毒株。本专利技术还提供了一种伪狂犬病灭活疫苗，包含所述的伪狂犬病毒减毒株。本专利技术伪狂犬病毒减毒株由新分离的Ⅱ型伪狂犬病毒毒株经过gE和TK双基因缺失处理获得，致病力减弱，免疫原性强，用该伪狂犬病毒减毒株制备的灭活疫苗或减毒活疫苗可对猪只和小鼠等猪伪狂犬病毒易感动物提供有效免疫。附图说明图1为实施例1中病料上清接种vero细胞结果图，其中A为实验组，B为阴性对照组。图2为实施例1中病料上清抽取DNA后gE特异性基因片段扩增结果图，其中泳道M：DNAMarker，泳道1：实验组，泳道2：阴性对照组。图3为gB基因进化树分析结果图。图4为gC基因进化树分析结果图。图5为gE基因进化树分析结果图。图6为TK基因进化树分析结果图。图7为全基因组核苷酸序列进化分析结果图。图8为重组病毒在Vero细胞上出现红色荧光的荧光显微镜观察图，其中A：PRV-DX和PRV-DXgE-/Cherry+两种混合毒；B：纯的PRV-DXgE-/Cherry+缺失毒。图9为重组病毒在Vero细胞上出现绿色荧光的荧光显微镜观察图，其中A：PRV-DXgE-和PRV-DXgE-/TK-/EGFP+两种混合毒；B：纯的PRV-DXgE-/TK-/EGFP+重组病毒。具体实施方式材料：临床上疑似猪伪狂犬病患病仔猪脑组织病料：来源于浙江湖州某猪场。PRV-SC病毒为传统的猪伪狂犬病毒株，购自中国兽医药品监察所。pMCherry-C1质粒、pEGFP-C2质粒均为本实验室保存；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自上海生工有限公司；PrimeSTAR聚合酶、dNTPmix、Pyrobest高保真酶、rTaq聚合酶、10×PCRbuffer、2×GCbuffer、100bpMaker、PUC18质粒、pMD18-TKit均购自宝生物工程(大连)有限公司；胎牛血清购自Gbico公司；MEM培养基购自Invitrogen，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；PCR产物清洁回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自TIANGEN。低熔点琼脂粉购自Sigma公司。5-6周龄雌性Balb/c小鼠购自浙江省实验动物中心，8-9周龄三元猪购自浙江省宁波市某集约化猪场。60日龄实验猪购自宁波宁海跃龙街道元红农庄，经抗原抗体检测，实验猪PRV、PPV、PCV2、PRRSV及CSFV抗原阴性，PRV及PRRSV抗体阴性。25cm2和75cm2细胞培养瓶购自比利时ORANGESCIENTIFIC公司。荧光定量PremixExTaqTM(ProqPCR)购自TaKaRa公司。荧光定量PCR管和板购自AXYGEN公司。TRIzolReagent购自GIBCO公司；RevertAidTMFirstStrandcD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病毒减毒株，其特征在于，命名为猪伪狂犬病病毒双缺株PRV‑HD/c，保藏号为CGMCC No.14325。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒减毒株，其特征在于，命名为猪伪狂犬病病毒双缺株PRV-HD/c，保藏号为CGMCCNo.14325。2.如权利要求1所述的伪狂犬病毒减毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离获得野生型伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCCNo.14326；(2)敲除猪伪狂犬病病毒PRV-DX毒株基因组中的gE和TK两个基因后通过病毒拯救获得所述伪狂犬病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，邢刚，金玉兰，顾金燕，颜焰，尹笛，廖敏，周赟，郑肖娟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33