一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法技术

技术编号:17506136 阅读:129 留言:0更新日期:2018-03-20 20:35
本发明专利技术涉及一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明专利技术将野生型腐败梭菌α毒素成熟毒素的第54位半胱氨酸突变为亮氨酸,第264位天冬酰胺突变为丙氨酸,第269位组氨酸突变为丙氨酸,第310位色氨酸突变为丙氨酸,获得了对于动物体无毒的α毒素突变体,并在突变蛋白的C端加上6组氨酸标签,作为制苗用抗原。同时公开了含有所述腐败梭菌α毒素无毒突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。采用本发明专利技术制备的腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗其效力远高于现有疫苗,而且大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。此外,凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势,无需增大联苗的使用剂量,即可制备联苗。

Recombinant subunit vaccine of alpha toxin of Clostridium Clostridium and its production method

The present invention relates to a recombinant subunit vaccine of alpha toxin of Clostridium Clostridium and its production method. The invention of the wild-type Clostridium septicum alpha toxin mature toxin fifty-fourth cysteine mutation of leucine, 264th ASN mutated to alanine, histidine 269th mutated to alanine, 310th tryptophan mutated to alanine, obtained for alpha toxin of animal body non-toxic mutants, and mutations in the protein C end plus 6 histidine tag, used as a vaccine antigen. At the same time, the recombinant expression vector and the recombinant host cell containing the nontoxic mutant encoding gene of Clostridium Clostridium alpha toxin are also disclosed. The recombinant subunit vaccine of Clostridium Clostridium alpha toxin prepared by the invention is much more effective than the existing vaccine, and greatly reduces the biological safety risk in the process of vaccine production. In addition, with the advantage of high concentration of the semi finished protein of the vaccine, the vaccine can be prepared without increasing the dosage of the combined vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
腐败梭菌(Clostridiumseptium)是一种革兰氏阳性厌氧杆菌,可引起动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽病以及坏死性肠炎等疾病,羊经由消化道感染该菌,引起的羊快疫(Braxy)是一种常见、多发、非接触、急性和致死性传染病。该菌可分泌α、β、γ和δ等多种外毒素,其中α毒素是其主要的致病性毒力因子和免疫保护性抗原,该毒素具有溶血、致死和坏死三种生物活性,能使消化道粘膜(尤其是真胃粘膜)发生炎症和坏死,同时经血液循环进入体内,会刺激中枢神经系统,引起动物急性休克而迅速死亡。腐败梭菌广泛分布于土壤、粪便、灰尘、沼泽及动物的消化道中,易通过被芽孢污染的饲料、饮水和周围环境等途径,经伤口或消化道引起羊、马、牛、猪、犬、猫、鸡、鹿等动物和人的恶性水肿病、肌肉坏死、气性坏疽以及坏死性肠炎等疾病,发病与动物的年龄、性别及品种无关。其传染途径一般有两种,一种是由于外伤如去势、断尾、分娩、外科手术、注射等没有严格消毒,致使腐败梭菌芽孢污染而引起感染,这种情况多为散发;另外一种经消化道感染,此时多呈地方流行,多发于秋、冬和初春气候骤变,阴雨连绵的季节。实验动物小鼠、豚鼠以及家兔均易感。此外,鸽也可感染,发病传播过程具有传播快、发病急、病程短、死亡率高的特点。绵羊对羊快疫最为易感,发病羊的营养多在中等以上,对畜禽养殖业的危害较大。因此,对该菌的研究具有十分重要的病原学和公共卫生学意义。由腐败梭菌引起的疾病如快疫,一般病程极为短促,往往来不及治疗动物即发生死亡。因此,免疫接种是预防该病最为有效途径之一。目前,我国对羊快疫的免疫预防,多采用灭活疫苗,有羊快疫和黑疫二联苗或羊快疫、猝疽、肠毒血症三联苗。免疫方法为,不论大小羊,均5.0mL/只皮下或肌肉注射免疫。国外用纯化后的腐败梭菌α素经甲醛脱毒制成类毒素,然后将铝磷酸盐凝胶作为佐剂与之混合制成类毒素疫苗,免疫动物后,机体对不同型的腐败梭菌及其芽孢均有抵抗力。目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗,在预防动物腐败梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果,但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷,例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等;其在制备过程中涉及外毒素的灭活,存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患;此外,培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原,接种动物易产生不良反应,导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此,开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的腐败梭菌毒素基因工程疫苗,是未来的发展方向。本专利技术专利制备的腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,系采用经过密码子优化、含有4个氨基酸突变的重组腐败梭菌α毒素蛋白生产,即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象,从而保持其免疫原性,又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时,该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点,是我国现行腐败梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,用于预防由腐败梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组腐败梭菌α毒素蛋白;制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mCSA株,该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCCNo.14650。2.本专利技术所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述重组腐败梭菌α毒素蛋白,与野生型腐败梭菌α毒素成熟毒素相比,含有4个氨基酸突变,分别为第54位半胱氨酸突变为亮氨酸,第264位天冬酰胺突变为丙氨酸,第269位组氨酸突变为丙氨酸,第310位色氨酸突变为丙氨酸。同时,在C端加上6组氨酸标签。3.本专利技术所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述重组腐败梭菌α毒素蛋白,其重组表达载体的基因序列经过密码子优化,更易于在大肠杆菌中实现高表达。4.本专利技术所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述重组腐败梭菌α毒素蛋白为无毒突变体,大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。5.本专利技术所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述重组腐败梭菌α毒素蛋白,其C端含有6组氨酸(6His)标签,便于蛋白的纯化。6.本专利技术所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗的制备方法,其特征在于用所述表达腐败梭菌α毒素重组蛋白的大肠埃希氏菌BL21/mCSA株作为疫苗生产菌株,经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、包涵体分离纯化后,加双相油乳佐剂混合制成。本专利技术具体实施方式1.腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗的制备(1)菌种:制苗用菌种为重组表达腐败梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌BL21/mCSA株,该菌种表达的腐败梭菌α毒素蛋白含有4个氨基酸突变(第54位半胱氨酸突变为亮氨酸,第264位天冬酰胺突变为丙氨酸,第269位组氨酸突变为丙氨酸,第310位色氨酸突变为丙氨酸),且重组蛋白的C端添加了6组氨酸标签。该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCCNo.14650;由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。(2)一级种子繁殖及鉴定:将冻干菌种用少量LB液体培养基融解,划线接种于含卡那霉素的LB固体平板,置37℃培养12~16小时,选取符合标准的单个菌落,接种含卡那霉素的LB液体培养基,置37℃培养8~12小时,与50%甘油等比例混合后分装,经纯粹检验合格后,作为制苗用一级种子。(3)二级种子繁殖及鉴定:取一级种子,按1%的量接种含卡那霉素的LB液体培养基,置37℃振荡培养8~12小时,即为二级种子。(4)制苗用抗原制备:取合格的二级种子,按培养基总量的2%接种含卡那霉素的LB液体培养基,发酵罐内培养。设置培养参数为:培养温度37℃,pH值7.0,溶氧40%。当培养物OD600值为10~15时,将温度降至28℃,加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG诱导培养4h。(5)破菌:离心收集菌体,按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.20.02mol/LTris缓冲液,0.3mol/LNaCl)的比例重悬菌体,4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min,弃去上清液,收集沉淀的包涵体。(6)纯化:按每克包涵体用5ml溶解液(6mol/L盐酸胍,20mmol/LTris-HCl,pH值8.0)的比例在室温下以200r/min振荡溶解2小时后,4℃10000r/min离心30min,收集上清液(7)蛋白含量检测:用BCA法检测蛋白含量。应不低于0.4mg/ml。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描,蛋白纯度应不低于60%。(8)无菌检验:按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会,中华人民共和国兽药典,二〇一五年版三部,中国农业出版社本文档来自技高网
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一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法

【技术保护点】
一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组腐败梭菌α毒素蛋白;制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/mCSA株,该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCC No.14650。

【技术特征摘要】
1.一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组腐败梭菌α毒素蛋白;制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠埃希氏菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mCSA株,该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCCNo.14650。2.如权利要求1所述腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗,其特征在于所述重组腐败梭菌α毒素蛋白,与野生型腐败梭菌α毒素成熟毒素相比,含有4个氨基酸突变,分别为第54位半胱氨酸突变为亮氨酸,第264位天冬酰胺突变为丙氨酸,第269位组氨酸突变为丙氨酸,第310位色氨酸突变为丙氨酸。同时,在突...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈小云杜吉革薛麒朱真王磊印春生李启红康凯姚文生
申请(专利权)人:中国兽医药品监察所
类型:发明
国别省市:北京,11

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