一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）的生产方法。该方法采用反转录后的聚合酶链式（ＲＴ－ＰＣＲ）反应，钓取人粒细胞集落刺激因子基因，转化Ｅ．ｃｏｌｉ菌；蛋白以中空纤维超滤透析方式复性，经离子交换层析、疏水层析和分子筛层析顺序组合，纯化，大规模制得高纯度的药用ｒｈＧ－ＣＳＦ蛋白。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体地说是人中性粒细胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA克隆的获得，表达G-CSF菌种的构建，及G-CSF大规模纯化，制成药品。人外周血各种成熟血细胞均源自于骨髓造血干细胞的分化增殖，从造血干细胞到外周成熟细胞之间，存在一系列调节因子，形成网络，控制着人体各种血细胞的数量和功能，维持机体白细胞的稳定。人G-CSF是该网络中存在于正常人体，刺激CFU-GM分化为CFU-G的因子，具有刺激前体细胞分化增殖为成熟外周中性粒细胞并增强其功能的蛋白质调节因子。人G-CSF的发现是从生物活性研究开始的，早在1980年，Asano等人发现一些癌症患者体内有粒细胞增多现象，当把这些人癌细胞移植到裸鼠体内后也发生粒细胞增多现象，表明人癌细胞可产生一种使鼠粒细胞增多的集落刺激因子(CSF)。把人口腔(鳞状)癌细胞株chu-2的条件培养液在体外刺激人和小鼠骨髓细胞时，能形成嗜中性粒细胞集落人膀胱癌5637细胞株的条件培养液，能诱使人骨髓白血病细胞素HL-60和小鼠粒单系白血病细胞系WEHI-3BO+分化，故被称为多向刺激因子。(Sonia.LM.Amgen Patent 1985.08.23US 768,959； Sonia.LM.1986 Science 23761-65)后来Strife等发现，如果骨髓细胞样品在去除成熟髓系和淋巴系细胞后，再用这种多向刺激因子作用，则其促进嗜中性粒细胞集落形成，其多向刺激活性是由于辅助细胞的间接作用造成的。随后，从上述条件培养基中分离纯化出具有粒细胞集落刺激活性的蛋白组份，它是一种小分子糖蛋白，分子量在18-22KD其糖基化与否并不影响G-CSF刺激嗜中性粒细胞分化增殖的活性。仅影响体内清除速率、稳定性，并进一步证实其受体细胞主要是嗜中性细胞，是嗜中性粒细胞终端分化和活化因子。在人体正常生理状态下，主要由单核巨噬细胞系产生。由于80年代基因重组技术的飞速发展，已能利用DNA重组技术大量生产可供临床应用的人重组G-CSF。美国柯瑞英-艾格公司就重组生产G-CSF获得专利(优先权号US 768949和US 835548，中国专利号ZL86106234)专利技术人通过从膀胱癌细胞株5637(A1)中提取总RNA，纯化出PolyA+RNA，制备cDNA库，转化E.coliHB101备用，再把天然极微量的G-CSF纯化，测序，设计并合成一组20bp左右混合探针，利用此探针与cDNA文库杂交，筛选出编码G-CSF的cDNA，扩增这些阳性克隆后，切下G-CSF基因进行序列分析，然后把此基因重组于如PNWI等表达载体，并转化于E.coli中表达G-CSF蛋白。由于人体中含有的天然的G-CSF极其稀少，在如此稀少的情况下把它纯化，用于准确分析N-氨基酸序列是极其困难的，并且混合探针设计合成耗费试剂，设备，且杂交条件严格，工作量大。利用基因工程手段构建的表达外源目的基因的菌株常采用E.coli表达系统，且多以包含体形式表达于菌体内。包含体是以表达产物为主，聚集形成的蛋白性质的颗粒，目的蛋白具有正确的一级结构顺序，但缺乏正确的构象，因而不具备其生物活性，欲研究或利用其生物活性，必须先经变性剂充分增溶，尔后经复性过程恢复其天然构象，才能显示其活性。到目前为止，复性完全是自发的和随机的，因此复性速度慢，回收率低，目前国内外所用的蛋白质复性方法均是依据排除使蛋白变性的环境，具体采用透析或大量稀释方法，降低变性剂浓度，使目的蛋白复性。透析法需要时间长，一般要24小时以上，且需要多次更换透析溶液，更主要的是透析袋内部溶液在透析过程中是不均一的，靠近透析膜的溶液变性剂浓度下降快而内部下降慢，只有部分蛋白处于适于复性的变性剂浓度范围，其它蛋白很容易聚集、絮凝、沉淀，使复性回收率下降，而稀释法的大体积稀释试样给后工序的纯化工艺带来不便，而且要增大设备的处理容量。虽有用中空纤维以超滤方式进行复性，但均采用内压式中空纤维，这方式类似于血透原理，虽然可以用于大规模生产，但存在下述缺点复性蛋白溶液自中空纤维一端流向另一端，变性剂浓度变化剧烈，蛋白被浓缩，部份蛋白来不及复性就超过折叠范围，沉淀析出，此沉淀进一步聚集在中空纤维内，堵塞通路，造成压力上升，中空纤维破损。而且此方式不利于NaOH在位清洗。本专利技术的目的是提出一种新的改进的，获得G-CSF cDNA的方法，以及一种新的有效表达系统，使能高效生产G-CSF。本专利技术的目的还在于提供一种使变性蛋白复性的简便，快速，高活性回收率，处理量大的新方法。本专利技术还有一个目的是提供一种工业化药品生产具有人G-CSF活性多肽的纯化方法。本专利技术的目的是这样实现的利用PCR技术设计一对引物从人血白细胞总RNA中直接钓出G-CSF cDNA(参表I)，测序正确后扩增获得较多G-CSF cDNA，并构建于依赖T7 RNA聚合酶的表达载体PGENS1(参图6)成为表达型重组体PGENSG，转化E.coli BL21(DE3)plysS，筛选后获得表达G-CSF的阳性克隆，经发酵、离心收集、匀浆破碎后得到含目的蛋白的包含体。根据附图说明图1，组成复性装置，将待复性蛋白及起始复性液置于复性反应器中，用蠕动泵抽出蛋白液，经中空纤维外侧功能层由下端注入中空纤维柱，变性剂因超滤作用进入纤维中心管路并注入废液缸，而蛋白沿管壁外侧重新回到复性反应器中，同时以同样速度将贮液注入复性反应器，使反应器内体积维持恒定，经不断循环，反应器中变性剂浓度逐步下降，变性蛋白在温和的条件下完成水合表面的脱水过程和折叠过程，直至复性。复性后蛋白仍含有杂蛋白、热源、核酸，须进一步去除，本专利技术设计了离子交换层析接疏水层析，后接分子筛层析的顺序组合。离子交换层析填料为DEAE，Q或QAE。rhG-CSF等电点介于5.8-6.2，PH适于7.0-9.0，可直接以复性时稀释液作为上样平衡液，平衡离子交换柱，尔后将复性浓缩好的G-CSF蛋白溶液直接上样，并以上述相应的流动相加0.01-0.5N NaCl梯度进行洗脱，此条件下洗脱的G-CSF蛋白可将复性过程中错配构象及多聚体除去，参图2。疏水柱选用butyl-，phenyl-或octyl基的疏水填料，将离子交换收集的目标峰直接补加0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl，即可上样于疏水柱，疏水柱以离子交换时相应的流动相加上述0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl平衡柱子，上样结束后以20-50mM磷酸缓冲液，PH7.0-9.0洗脱。因磷酸盐具有一定盐析作用，目标蛋白仍吸附在柱上，而在此充分洗涤的过程中核酸及热原被充分洗脱，尔后以Tris盐酸缓冲液或咪唑缓冲液及水顺序地阶段洗脱。G-CSF目标峰在Tris盐酸或咪唑盐酸缓冲液的洗脱峰中。经疏水层析后收集的目标峰，可直接上样于以5-50mM醋酸-醋酸钠为流动相平衡好的Sephacryl或Superdex层析柱，进行精制。本专利技术所用此流动相旨在将可能存在的寡聚体进一步去除的同时，可以将前述疏水条件下的体系改换为5-50mM醋酸-醋酸钠，经此分子筛层析得到的目标蛋白G-CSF，可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）的生产方法，其特征在于以反转录后的聚合酶链式（ＲＴ－ＰＣＲ）反应方法，钓取人外周血白细胞中粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因的ｃＤＮＡ，构建重组质粒，转化Ｅ．ｃｏｌｉ菌；以外压式或内压式中空纤维超滤透析复性；以离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析顺序组合纯化，大规模制得高纯度的药用ｒｈＧ－ＣＳＦ蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏勇，孔铁山，王昌梅，黄岩山，孙汉栋，
申请(专利权)人：杭州九源基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]