抗肿瘤化合物及其制备方法和制药用途技术

本发明专利技术涉及式Ａ所示的化合物３β，５α，６β，７α－四羟基－８（９），２２Ｚ－二烯麦角烷［ｅｒｇｏｓｔａ－８（９），２２－ｄｉｅｎｅ－３，５，６，７－ｔｅｔｒａｏｌ（３β，５α，６β，７α，２２Ｚ），简称为化合物Ａ］以及从海洋植物真菌２０５９（保藏号ＣＣＴＣＣＭ２０２０３０）的菌体中提取分离制备化合物Ａ的方法和化合物Ａ在制备抗肿瘤药物中的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有抗肿瘤活性的化合物3β，5α，6β，7α-四羟基-8(9)，22 Z-二烯麦角烷及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
自从青霉素(penicillin)引入了医学，就标志着真菌抗生素的时代已经开始。在过去的60年里，从陆地真菌发现了大量的结构独特的天然产物，其中很多已用作药物或作为生物医药发展的潜在工具。真菌的代谢产物作为药物的丰富来源，很多在临床上作为抗生素应用，大量的研究表明，真菌的代谢产物还有其它的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂，酶抑制剂等。由于海洋环境的特殊性，海洋真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，能提供陆生真菌无法提供的代谢产物。国际上已从海洋真菌中发现了一些结构独特的化合物，分别具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤和心血管方面的活性。例如，1945年7月，Giuseppe Brotzu发现顶头孢霉(Cephalospoiun acremonium)有抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生长的活性，后经分离得到多种抗菌素，即头孢菌素。五十多年过去了，头孢菌素在临床上仍广泛使用。从真菌筛选，到半合成结构改造，目前产品品种已达200多种，产量占世界上抗生素产量的60％以上，堪称后起之秀。还有其他的一些例子见Kerstin Liberra的文章《Marine fungi-a profileresource of biologically active natural products？》，国际上这方面的研究从八十年代以来呈加速发展的趋势。国内从海洋真菌中也发现一批新的活性物质(Lin YC et al Tetrahedron2000，Lin YC et al Tetrahedron Letters，2000，Lin YC et al J.Org.Chem.2001)。有关四羟基甾醇的文献报道，目前还非常少。从陆地木腐菌Polyporus versicolor，真菌Agaricus blazei的子实体和海绵Spongia officinali和中国苦红菇Russula rosacea中分离到一种四羟基甾醇Ergosta-7，22-diene-3，5，6，9-tetraol(3β，5α，6β，9α)。T.Ishizuka等从真菌Grifola frondosa的子实体中，分离到18个甾醇类化合物，其中有两个四羟基甾醇Ergosta-8(9)，22-diene-3，5，6，7-tetraol(3β，5α，6β，7α，22E)和Ergosta-8(14)，22-diene-3，5，6，7-tetraol(3β，5α，6β，7α，22E)。根据文献报道，四羟基甾醇基本上都具有细胞毒活性，但三羟基甾醇很多并不具有细胞毒，羟基的存在和细胞毒性之间的关系，四羟基甾醇作用机理等现在都还不清楚，这些也都值得进一步的研究。植物内源性真菌(endophytic fungi)生活在高等植物的组织中，对于内源性真菌的次级代谢物的研究还较为缺乏。据保守的估计内源性真菌的种类繁多，大约有1.5×106种，由于数量庞大，而且与其它生物之间紧密的生态关系，使这类真菌成为潜在的具有产生丰富的次级代谢物的来源。目前国内其它单位对生长于海洋环境的内源性真菌的次级代谢物的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的具有潜在药用价值的新化合物及其从海洋植物内生真菌提取分离的方法，以及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本专利技术化合物A为下列结构式所示 本专利技术的化合物A可以从海洋植物真菌，例如南海海洋红树林Castaniopsis fissa的内生真菌2059(以下称为海洋植物真菌2059)的菌体中提取分离而得到。本专利技术所用的海洋植物真菌2059已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉大学校内)，保藏号为CCTCC №M202030，保藏日为2002年8月3日。本专利技术化合物A的制备方法包括以下步骤a.海洋植物真菌CCTCC M202030的种子培养选用PDA(potato dextro se agar)培养基，其组成为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，25-28℃培养5-7天；b.海洋植物真菌CCTCC M202030的发酵培养发酵培养基成分配比按重量比为葡萄糖5-15，酵母提取物0.5-1.5，蛋白胨1-3，粗海盐30-50，水1000；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-30℃静置1-2月；c.将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；d.菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；e.用乙酸乙酯溶解提取物，溶解物在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗；f.收集石油醚-乙酸乙酯(1∶3)得到的洗脱组分，进一步硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(7∶1)为洗脱剂，纯化得到白色无晶形固体，即为所需的化合物A。本专利技术的试验证明，化合物A能抑制肿瘤细胞株的生长，在以人肝癌细胞株和人大细胞肺癌细胞株为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，化合物A的半数致死量IC50分别为8.445和5.03μg/ml。表明化合物A可用于制备抗肿瘤药物。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1化合物A的制备a.海洋植物真菌CCTCC M202030的种子培养菌种以PDA为培养基，组成为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L。制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，25-28℃培养7天后于4℃保存。b.海洋植物真菌CCTCC M202030的发酵培养发酵培养基组成为葡萄糖10g，酵母提取物1g，蛋白胨2g，粗海盐40g，水1L；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-28℃静置培养1个月；c.将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；d.菌体在室温下用甲醇浸泡7天，共浸提3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到总提取物；e.用乙酸乙酯溶解提取物，溶解物在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗；f.收集由石油醚-乙酸乙酯(1∶3)洗脱得到的组分，进一步硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(7∶1)为洗脱剂，纯化得到白色无晶形固体化合物A。化合物A的试验数据m.p.145～150℃。元素分析(w％，C28H46O4)C 75.54，H 10.22，N 0.000；计算值C 75.34，H 10.21，N 0.000；IRυ/cm-1(KBr)3423，2959，2872，1668，1634，1461，1378，1276，1158，1067，969，915，878，805，733。APCI-MS429+，411+，393+，375+，267，251，187，171，131，105等。化合物A的NMR实验数据如表1所示。实施例2MTT还原法检测化合物A抗肿瘤活性试验1.材料1.1四脞盐(MTT)用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4.5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenytetrazolium bromide，SIGMA)终浓度5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。1.2MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸钠(SDS，华美生物工程公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
下述结构式所示的化合物Ａ：＊＊＊ Ａ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林永成，李厚金，周世宁，佘志刚，关利平，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]