本发明专利技术公开了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由包含日本血吸虫MRP1基因片段的重组载体经表达而制得，所述MRP1基因片段的序列为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了上述日本血吸虫重组抗原在制备诊断日本血吸虫病的产品中的应用。本发明专利技术的日本血吸虫重组抗原rSjMRP1，用于诊断日本血吸虫病，敏感性高、特异性强，对于血吸虫病防治具有重要意义。
Recombinant antigen rSjMRP1 of Schistosoma japonicum and its application
The invention discloses a recombinant Schistosoma japonicum antigen, the recombinant antigen of Schistosoma japonicum by recombinant vector containing MRP1 gene fragment by the expression system, the sequence of MRP1 gene fragment of the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO.1 of amino acid sequence shown. The present invention also discloses the application of the recombinant antigen of Schistosoma japonicum in the preparation of the products for the diagnosis of schistosomiasis japonicum. The recombinant antigen rSjMRP1 of Schistosoma japonicum is highly sensitive and specific for the diagnosis of schistosomiasis japonica, and is of great significance for the prevention and treatment of schistosomiasis.
【技术实现步骤摘要】
日本血吸虫重组抗原rSjMRP1及其应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种日本血吸虫重组抗原rSjMRP1及其在日本血吸虫病诊断中的应用。
技术介绍
血吸虫病发生在热带和亚热带，是世界范围内最重要的寄生虫病，具有重要的社会经济意义。血吸虫病在74个国家流行，大约1亿2千万人为有症状性感染，2千万人受到严重影响。尽管在低感染度下很少引起死亡，但是它的复发特性使它成为终身失调的慢性病。在我国流行的是日本血吸虫病，该病在长江中下游沿岸5省(湖南、湖北、江西、安徽和江苏)以及四川、云南2省流行。虽然我国血吸虫病防控取得显著成效，但迄今仍然是主要的公共卫生问题之一。至2013年年底全国仍有血吸虫病患者约184943例，其中急性血吸虫感染病例9例，当年死亡1700例；2012年全国湖南省、湖北省、江西省、安徽省、江苏省、四川省、云南省7个流行省牛血吸虫病的粪便毛蚴孵化法检测阳性率为0.58％，推算的理论病牛数为5284头。患病家畜，特别是病牛，是我国最重要传染源。及时发现病畜并给予治疗是有效控制传染源的重要途径。长期以来，家畜血吸虫病的诊断和监测主要采用病原学诊断技术----粪便毛蚴孵化法。随着我国血吸虫病防控和疫情控制巨大成就的取得，我国家畜血吸虫感染率和感染度越来越低，传统的病原学诊断技术在发现病畜和确定治疗对象方面越来越困难。免疫学诊断技术主要采用虫卵可溶性抗原(SEA)检测抗体的技术，包括ELISA、IHA等；但SEA抗原和其它吸虫如片型吸虫感染血清有较高的交叉反应。虽然在基因工程诊断抗原研究方面已有不少报道，但目前还没有一种基因工程抗原可以开展大规模的应用。继续筛选敏感特异的诊断抗原是我国血吸虫病防治的一大需求。
技术实现思路
本专利技术要解决目前缺乏敏感特异的血吸虫病诊断抗原的技术问题，提供一种日本血吸虫重组抗原rSjMRP1，该重组抗原用于诊断血吸虫病，敏感性高、特异性强。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原是由包含日本血吸虫MRP1(多药耐药性蛋白1)基因片段的重组载体经表达而制得，所述MRP1基因片段的序列为编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述MRP1基因片段的序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组载体，包含日本血吸虫MRP1基因片段，该MRP1基因片段的序列为编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组抗原在制备诊断日本血吸虫病的产品中的应用，所述重组抗原为日本血吸虫MRP1重组抗原蛋白，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。所述产品包括试剂盒、或检测芯片。在本专利技术的另一方面，还提供了一种诊断日本血吸虫病的试剂盒，包含日本血吸虫MRP1重组抗原蛋白，该重组抗原蛋白具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。所述试剂盒还包含ELISA酶标板、酶标二抗、酶底物液。所述试剂盒还包含阳性对照血清、阴性对照血清。在本专利技术的另一方面，还提供了一种诊断日本血吸虫病的检测芯片，包含日本血吸虫MRP1重组抗原蛋白，该重组抗原蛋白具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术日本血吸虫重组抗原rSjMRP1，作为血吸虫病诊断抗原，对羊血吸虫病的敏感性为95.6％，特异性为100％，对水牛血吸虫病的敏感性为90％，特异性为96.67％，对黄牛血吸虫病的敏感性为100％，特异性为100％，而与东毕吸虫、捻转血矛线虫感染羊血清没有交叉反应，表明本专利技术的重组抗原rSjMRP1，用于血吸虫病诊断，敏感性高、特异性强，对于血吸虫病防治具有重要意义。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的ProteinG纯化三种动物IgG结果图；图2是本专利技术实施例2的重组质粒双酶切鉴定结果图；图3是本专利技术实施例2的SDS-PAGE分析重组蛋白时相表达量的结果图；图4是本专利技术实施例2的WesnternBlot检测重组蛋白抗原性结果图；图5是本专利技术实施例3的rSjMRP1(A)和SEA(B)羊血吸虫病诊断结果图；图6是本专利技术实施例3的rSjMRP1(A)和SEA(B)水牛血吸虫病诊断结果图；图7是本专利技术实施例3的rSjMRP1(A)和SEA(B)黄牛血吸虫病诊断结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。本专利技术采用感染日本血吸虫的羊、水牛、黄牛血清IgG依次筛选日本血吸虫成虫(44d)噬菌体展示cDNA文库，对获得阳性克隆中的插入序列进行序列测定和生物信息学分析，得到了20个正确展示的噬菌体克隆，其中编码多药耐药性蛋白1(putativemultidrugresistanceprotein1，MRP1)的基因有20个重复，为筛选出的重复最多的EST序列。根据所获基因在NCBI(或Genedb)数据库中的已知序列，选择包含筛选出EST序列基因部分片段，设计引物，以PCR技术分别扩增MRP1基因，构建重组表达质粒pET-28b(+)-SjMRP1，在BL21中IPTG诱导表达，纯化表达的重组蛋白rSjMRP1，分子量约为34.1kDa，WesternBlot检测重组蛋白rSjMRP1具有较好的抗原性。ELISA法评估重组蛋白rSjMRP1对羊、水牛和黄牛血吸虫病的诊断效果，结果显示重组蛋白rSjMRP1对羊血吸虫病的敏感性为95.56％(86/90)，特异性为96.67％(29/30)，对水牛血吸虫病的敏感性为90％(81/90)，特异性为96.67％(29/30)，对黄牛血吸虫病的敏感性为100％(22/22)，特异性为100％(30/30)，与东毕吸虫、捻转血矛线虫感染羊血清没有交叉反应。说明本专利技术重组蛋白rSjMRP1在羊、水牛、黄牛等动物血吸虫病的检测方面具有较高的诊断应用价值。实施例1家畜阳性血清IgG筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库1.材料日本血吸虫成虫(Sj44d)噬菌体展示cDNA文库由本研究室构建、保存，库容量为4.98×106pfu，重组率为93.8％，其中95.6％的插入片段大于300bp(孙毅等，2007)。血吸虫尾蚴由本研究室钉螺室提供。羊、水牛、黄牛血吸虫阳性血清(粪检阳性)为本研究室用日本血吸虫尾蚴攻击感染后采集、保存。T7噬菌体宿主菌BLT5403购自Novagen公司。T7载体引物序列由T7Select10-3bCloningKit说明书提供，Invitrogen公司合成，上游引物序列为5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′(SEQIDNO.4)，下游引物序列为5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′(SEQIDNO.5)。2.方法2.1羊、黄牛、水牛日本血吸虫阳性血清抗体纯化按照产品说明书，用ProteinG亲和层析柱亲和层析纯化IgG。主要步骤如下：分别取实验室保存的羊、黄牛、水牛三种动物阳性血清各本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种日本血吸虫重组抗原，其特征在于，该重组抗原是由包含日本血吸虫MRP1基因片段的重组载体经表达而制得，所述MRP1基因片段的序列为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种日本血吸虫重组抗原，其特征在于，该重组抗原是由包含日本血吸虫MRP1基因片段的重组载体经表达而制得，所述MRP1基因片段的序列为编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的日本血吸虫重组抗原，其特征在于，所述MRP1基因片段的序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫MRP1基因片段，该MRP1基因片段的序列为编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。4.一种包含权利要求3所述重组载体的宿主细胞。5.一种日本血吸虫重组抗原在制备诊断日本血吸虫病的产品中的应用，所述重组抗原为日本血吸虫...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金明，冯金涛，许瑞，金亚美，李浩，陆珂，傅志强，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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