一种微生物发酵法生产河豚毒素的方法技术

本发明专利技术公开了属于生物制剂制备技术的一种微生物发酵法生产河豚毒素的方法。是利用从红鳍东方豚分离出的能产生ＴＴＸ的海洋放线菌通过微生物发酵法生产河豚毒素。包括摇瓶发酵法、分批发酵法、半连续发酵法和连续发酵法，使用拟诺卡氏达松维尔放线菌ＲＧ－３Ｓ发酵生产河豚毒素，主要经过斜面菌种准备和种子液的制备、将种子液接入、在发酵培养基中发酵，适时的补加营养液；控制发酵温度，适当通风，连续发酵可达１个月。排出的发酵液离心后，经活性炭吸附脱色，然后用醋酸溶液洗脱过柱分离，浓缩后经冷冻干燥可得河豚毒素的纯品。本发明专利技术使用以海洋微生物发酵法产生河豚毒素，成本低，不受季节和原料的限制，不破坏生态平衡。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制剂制备
，特别涉及。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的海洋生物活性物质，为非蛋白类海洋神经毒素。试验表明该毒素能选择性地与神经和肌肉细胞膜表面的Na+通道上的蛋白质结合，阻断Na+通过，从而影响神经肌肉间兴奋性的传导。TTX除了用作神经生物学和生理学研究的工具药物外，在临床上对头痛、关节炎、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘等多种病症均有疗效，尤其是TTX还可用于局部麻醉、晚期癌症镇痛和戒毒，且具有用后不成瘾的优点，从而大幅度增加了对TTX的需求量，因而TTX具有很大的开发价值。2001年TTX结晶的国际市场售价为每克204,000美元(SIGMA)，比1996年时的价格(135,000美元/克)高51％。但是，目前国内外所用TTX仍然都是从河豚卵巢及肝脏等内脏中提取的，而且人工养殖河豚所含TTX量极低或无毒，这就存在着原料不足、提取不便等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，是利用从红鳍东方豚分离出的能产生TTX的海洋放线菌通过微生物发酵法生产河豚毒素。其特征在于所述微生物发酵法生产河豚毒素的方法包括摇瓶发酵法、分批发酵法、半连续发酵法和连续发酵法，现分述如下1)摇瓶发酵法斜面培养基配方为200g土豆汁；蔗糖20g；燕麦片4g；酪蛋白胨10g；氯化钠5g；用水补足至1L；pH7.2。按照斜面培养基的配方配制茄子瓶斜面，于27～29℃恒温培养箱中培养4～5天，待斜面长好后，储存于冰箱中供发酵用。配制种子培养基100～200g土豆汁；蔗糖3～20g；燕麦片2～5g；酪蛋白胨10～50g；氯化钠6～10g；用水补足至1L，灭菌前用1N氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，在121℃下、0.1MPa高压蒸汽灭菌30分钟，待培养基冷却至28℃以下时，将长好的斜面接入。500ml三角瓶装入150ml培养基。分别在27℃、29℃、30℃和31℃时，200～500转/分摇床培养96～120小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮并且聚集成团。将种子液接入发酵培养基中，发酵培养基的组成为200～400g土豆汁；蔗糖10～50g；燕麦片2～10g；酪蛋白胨5～50g；氯化钠5g，用水补足至1L，pH7.0～7.2。在121℃下、0.1MPa高压蒸汽灭菌。500ml三角瓶装入150ml发酵培养基。接入种子培养液15mL，分别在27℃、29℃、30℃和31℃时，200～500转/分摇床培养5～6天，至PH上升到7.8以上，菌丝开始出现断裂，发酵结束。将发酵液收集一起，进行离心处理，然后活性炭吸附，醋酸溶液过柱分离，浓缩，冷冻干燥得河豚毒素的纯品。2)分批发酵法斜面培养基的配制和接种同摇瓶发酵。种子罐投料系数为60～70％(v/v)，种子培养基成分为200～400g土豆汁；蔗糖20～50g；燕麦片2～5g；酪蛋白胨10～50g；氯化钠5～10g；用水补足至1L，灭菌前用1N氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至28℃以下时，将长好的斜面接入。在通风量(即发酵液体积与通入空气体积比)1∶(0.5～1)，27～29℃，200～500转/分搅拌培养96～120小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮并且聚集成团。发酵罐中发酵培养基的组成为200～400g土豆汁；蔗糖10～50g；燕麦片2～10g；酪蛋白胨5～50g；氯化钠5g；消泡油0.5～10g。用水补足至1L，灭菌前用1N氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至28℃以下时，将种子罐接入，接种10％的种子培养液(以发酵体积为基准)，在通风量1∶(0.8～1.15)，分别在27℃、29℃、30℃和31℃时，200～500转/分搅拌培养5～6天，至PH上升到7.8以上，菌丝开始出现断裂，发酵结束。3)半连续发酵法斜面菌种准备和种子液的制备过程同以上分批发酵所述，半连续发酵的发酵培养基组成可以是200～400g土豆汁；蔗糖10～50g；燕麦片2～10g；酪蛋白胨5～50g；氯化钠5g；消泡油0.5～10g。用水补足至1L，灭菌前用1N氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至28℃以下时，将种子罐接入，接种量为10％(以发酵体积为基准)，在通气量1∶0.8～1.15，27～29℃，200～500转/分条件下发酵培养，发酵进行120小时后，开始进行补料；所补的营养液配方为蔗糖10～30g；酪蛋白胨5～10g；消泡油0.5～10g；用水补足至1L。从第9天开始每小时取样镜检菌丝衰老与否。若有衰老现象则在流加营养液中增加总体积1％的酵母浸提物和0.5％的氯化钠。经过补料，补充新鲜的培养基和调整发酵条件，延长发酵过程，提高河豚毒素的产量。每次从排放孔中排出的含河豚毒素的发酵液可直接进行离心处理，然后用活性炭吸附，醋酸溶液过柱分离，浓缩，冷冻干燥得河豚毒素晶体。经若干天后，生产菌株均不可避免地出现衰老现象，如果菌体出现明显自溶现象，则可放罐。4)连续发酵法按照2～8个等容积或不等容积的发酵罐串连的连续发酵工艺进行设备改造，在2号罐以后各罐上设补料口，在排放孔和补料孔安装相应的管道阀门，罐之间通过相应的管道阀门连接。按照前面所述斜面培养基的配方配制茄子瓶斜面和试管斜面，预培养3天后，若未发现杂菌生长则进行接种，于27～29℃恒温箱中进行培养5～7天，待菌丝成熟后收取，贮存于4℃冰箱内备用。液体种子的培养基配方同分批发酵所述，发酵培养基可以与半连续发酵培养基完全相同。发酵培养基可通过连续蒸汽在线灭菌，将温度降至30℃左右后贮存于发酵培养基贮罐内。连续发酵工艺中，等容积罐串连为3或4个，温度1号罐和2号罐为27～29℃，3号罐为25～27℃；通风量1号罐为1∶(1-1.5)，2号罐为1∶(1-1.2)，3号罐(或4号罐)为1∶(0.8-1)，1号罐常开，2号和3号罐视溶氧情况常开或间歇开。其他发酵条件参照半连续发酵，在适当的时机向罐内流加新鲜营养液。在最后一个罐，即3号罐或4号罐排料，排料方式可参照半连续发酵进行，也可匀速不间断的排出成熟的发酵液。排出的含河豚毒素的发酵液可直接进行离心处理，然后用活性炭吸附，醋酸溶液过柱分离，浓缩，冷冻干燥得河豚毒素晶体。在连续发酵过程中，当生产菌的细胞普遍出现老化现象后，处理方法同半连续发酵。本专利技术的有益效果是使用以海洋微生物发酵法产生河豚毒素，成本低，不受季节和原料的限制，不破坏生态平衡；本专利技术使用的从红鳍东方豚分离出的能产生TTX的海洋放线菌3S(拟诺卡氏达松维尔放线菌)菌株进行分批、半连续或连续发酵，产毒培养基及产毒条件的优化，提高海洋微生物发酵产河豚毒素的产量达4小鼠单位/ml发酵液。具体实施例方式本专利技术提供，是利用从红鳍东方豚分离出的能产生TTX的海洋放线菌通过微生物发酵法生产河豚毒素。所述微生物发酵法生产河豚毒素的方法包括摇瓶发酵法、分批发酵法、半连续发酵法和连续发酵法，现分述如下1)摇瓶发酵法斜面培养基配方为200g土豆汁；蔗糖20g；燕麦片4g；酪蛋白胨10g；氯化钠5g；用水补足至1L，pH7.2。按照斜面培养基的配方配制茄子瓶斜面，于27～29℃恒温培养箱中培养4～5天，待斜面长好后，储存于冰箱中供发酵用。配制种子培养基为100～2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物发酵法生产河豚毒素的方法，利用从红鳍东方豚分离出的能产生ＴＴＸ的海洋放线菌，通过微生物发酵法生产河豚毒素；其特征在于：所述微生物发酵法生产河豚毒素的方法包括摇瓶发酵法、分批发酵法、半连续发酵法和连续发酵法，现分述如下：１） 摇瓶发酵法斜面培养基配方为：土豆汁２００ｇ，蔗糖２０ｇ，燕麦片４ｇ，酪蛋白胨１０ｇ，氯化钠５ｇ，用水补足至１Ｌ；ＰＨ７．２，按照斜面培养基的配方配制茄子瓶斜面，于２７～２９℃恒温培养箱中培养４～５天，待斜面长好后，储存于冰箱中供发酵 用；配制种子培养基为：土豆汁１００～２００ｇ，蔗糖２０～３０ｇ，燕麦片２～５ｇ，酪蛋白胨１０～５０ｇ，氯化钠６～１０ｇ，用水补足至１Ｌ；灭菌前用１Ｎ氢氧化钠溶液调ＰＨ７．０～７．２，在１２１℃下、０．１ＭＰａ高压蒸汽灭菌３０分钟，待 培养基冷却至２８℃以下时，将长好的斜面接入，５００ｍｌ三角瓶装入１５０ｍｌ培养基，分别在２７℃、２９℃、３０℃和３１℃时，２００～５００转／分摇床培养９６～１２０小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮并且聚集成团；将种子液接入发酵培养基中， 发酵培养基的组成为：土豆汁２００～４００ｇ，蔗糖１０～５０ｇ，燕麦片２～１０ｇ，酪蛋白胨５～５０ｇ，氯化钠５ｇ，用水补足至１Ｌ；ＰＨ７～７．２，在１２１℃下、０．１ＭＰａ高压蒸汽灭菌，５００ｍｌ三角瓶装入１５０ｍｌ发酵培养基，接种量为１０％（以发酵体积为基准），分别在２７℃、２９℃、３０℃和３１℃时，２００～５００转／分摇床培养５～６天，至ＰＨ上升到７．８以上，菌丝开始出现断裂，发酵结束，将发酵液收集一起，进行离心处理，然后活性炭吸附，醋酸溶液过柱分离，浓缩，冷冻干燥得河豚毒素的纯品；２）分批发酵法斜面培养基的配制和接种同摇瓶发酵，种子罐投料系数为６０～７０％（ｖ／ｖ），种子培养基成分为：土豆汁２００～４００ｇ，蔗糖２０～５０ｇ，燕麦片２～５ｇ，酪蛋白胨１０～５０ｇ，氯化钠５～１０ｇ，灭 菌前用１Ｎ氢氧化钠溶液调ＰＨ７～７．２，高压蒸汽灭菌，待培养基冷却至２８℃以下时，将长好的斜面接入，在通气量１：（０．５～１），２７～２９℃，２００～５００转／分搅拌培养９６～１２０小时，至外观较稠，镜检菌丝粗壮并且聚集成团；发酵罐 中发酵培养基的组成为：土豆汁２００～４００ｇ，蔗糖１０～５０ｇ，燕麦片２～１０ｇ，酪蛋白胨５～５０ｇ，氯化钠５ｇ，消泡油０．５...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣庆，谢莉萍，王书锦，胡江春，武振龙，马原栋，张锦芳，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]