本发明专利技术公开了一种肝素酶Ⅰ融合蛋白及其编码基因与表达方法。本发明专利技术所提供的肝素酶Ⅰ融合蛋白，是具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将ＳＥＱ ＩＤ №：２的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与ＳＥＱ ＩＤ №：２的氨基酸残基序列相同活性的由ＳＥＱ ＩＤ №：２衍生的蛋白质。本发明专利技术通过融合蛋白首次实现肝素酶Ⅰ在大肠杆菌中９０％以上以有活性、正确折叠的可溶蛋白形式存在；酶活可达２７０Ｕ／Ｌ发酵液（１０８ＵＬ↑［－１］ＯＤ↓［６００］↑［－１］），蛋白量可达１５０ｍｇ／Ｌ，并通过亲和分离实现该融合蛋白的一步纯化。本发明专利技术可广泛用于生产肝素酶Ⅰ。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和发酵工程领域中一种肝素酶I融合蛋白及其编码基因与表达方法。
技术介绍
肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol.3964-67)、鞘胺醇杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43813-816)、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然科学版)2002 Vol.39777-779)、环状芽孢杆菌Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al.，Purification and characterization of heparinasethat degrades both heparin and heparin sulfate from Bacillus circulansBioSci.Biotechnol.Biochem.2002 Vol.661181-1184)、解肝素拟杆菌Prevotellaheparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al.，Characterization of heparinasefrom an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem.1998Vol.123283-288)、粪便拟杆菌Bacteroides stercoris HJ-15(Dong Hyuu Kim etal.，Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroidesstercoris HJ-15 J.Biochem.2000 Vol.128323-328)和肝素黄杆菌Flavabacteriumheparinum(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(RobertJ.Linhardt et al.，Purification and characterization of heparin lyases fromFlavobacterium heparinum JBC 1992 Vol.26724347-24355)。肝素酶的研究有十分重要的意义(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，HavardUniversity；Sasiekharan，R.et al.，A comparative analysis of the primarysequences and characteristics of heparinase I，II，and III from Flavobacteriumheparinum Biochemical and Biophysical Research Communication 1996Vol.229770-777)肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝血药物低分子肝素；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理。肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，通常需要经过多步的色谱纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本。因此，目前利用黄杆菌生产肝素酶的成本极高，限制了肝素酶的应用发展。Ram Sasiekharan(1993)(Sasiekharan，R.et al.，Cloning and expression of heparinase I gene fromFlavobacterium heparinum Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1993 Vol.903660-3664)首先通过氨基酸测序，设计引物扩增得到了肝素酶I的基因序列并重组在大肠杆菌中实现了肝素酶的表达(表1)；但表达产物不能正确折叠形成有活性的蛋白。RamSasiekharan(1996)(Sasiekharan，R.et al.，Expression in Escherichia coli，Purification and characterization of heparinase I from Flavobacteriumheparinum Biochem.J.1996 Vol.315589-597)利用pET表达系统提高了蛋白表达量(14.4mg/L发酵液)(表1)，但重组肝素酶I仍然形成包涵体，需要复性才能形成活性蛋白。Oded Shoseyov(1999)(Etai Shpigel，et al.，Immobilizationof recombinant heparinase I fused to cellulose-binding domain Biotechnologyand Bioengineering 1999 Vol.6517-23)利用纤维素结合蛋白(CBD)与肝素酶融合，利用融合蛋白实现了CBD-hep、hep-CBD的融合表达，通过纤维素柱亲合分离，并提高了肝素酶I的表达量(150mg/L发酵液)(表1)；但是尽管在低IPTG(0.5mM)下诱导，该融合蛋白仍然形成包涵体，需要复性才能形成有活性的重组肝素酶I。表1.肝素酶I重组表达研究现状 来自大肠杆菌的天然的麦芽糖结合蛋白MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与大肠杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与amylose结合，实现亲和分离，也能与马铃薯淀粉结合实现亲和分离(廉德君等，一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法，生物化学与生物物理进展1998 Vol.25283-284；Usha Srinivasan et al.，Aconvenient method for affinity purification of maltose binding proteinfusions Journal of Biotechnology 1998 Vol.62163-167)，从而可大大降低酶的分离纯化的成本。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种肝素酶I融合蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的肝素酶I融合蛋白，名称为MBP-HepA，是具有序列表中SEQ ID№2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肝素酶Ⅰ融合蛋白，是具有序列表中ＳＥＱＩＤ№：２氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将ＳＥＱＩＤ№：２的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与ＳＥＱＩＤ№：２的氨基酸残基序列相同活性的由ＳＥＱ ＩＤ№：２衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈银，邢新会，娄恺，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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