一种制备低分子量肝素的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备低分子量肝素的方法。本发明专利技术的制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白－肝素酶Ⅰ融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白－肝素酶Ⅰ融合蛋白，是具有序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明专利技术的方法采用具有较高酶活的麦芽糖结合蛋白－肝素酶Ｉ融合蛋白制备肝素，通过控制降解时间，得到具有理想平均分子量和分子量分布较窄的低分子量肝素寡糖。本发明专利技术为低分子量肝素的酶法工业化生产提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别涉及一种利用肝素酶I融合蛋白MBP-HepA制备低分子量肝素的方法。
技术介绍
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重复单位的线形链状结构，其分子量在3000-37000之间，平均分子量为15000。自1916年首次发现肝素以来，其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。低分子量肝素(低分子量肝素寡糖)(简称LMWHs)(Robert J.Linhardt，PH.D.AndNur Sibel Guany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约为普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWHs的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外，LMWHs还具有一些其它优势，如分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长；不与肝素结合蛋白结合，因此有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以LMWHs既能有效防止血栓形成，又能减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作为肝素的替代物。不同聚合度(dp)的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用，从而呈现不同的生物学作用。分子量分布范围窄，相对比较均一的LMWHs的药效较好。在对LMWHs进行质量控制方面，各生产单位均规定了其平均分子量及分子量分布范围。所以，生产所需平均分子量的LMWHs及分子量分布范围窄的肝素寡糖，具有重要的意义。目前，LMWHs的制备方法(张万忠，王云山，马润宇，苏志国，国生化药物杂志，2001，22(1)48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法，主要有亚硝酸降解法、β-消去降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是，化学裂解肝素反应剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏，因而，某些生物活性功能在不同程度被或多或少的破坏。而酶降解法由于反应条件温和、产率高及对环境无毒性，成为许多糖生物学研究工作者的研究热点。美国专利(Nielsen，US 5106734，1992)利用232nm处的吸光度值控制产品质量，可制备出具有理想平均分子量的低分子肝素产品。于广利等(于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J.Linhardt，青岛海洋大学学报，2002，32(2)231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解，得到了聚合度2～20的寡糖纯品。高宁国等(高宁国，程秀兰，杨敬，张树政，微生物学报，1999，39(1)64-67)筛选出了一种能产肝素酶的鞘胺醇肝菌，并利用所产生的酶降解肝素，得到了一系列具有抗平滑肌增生活性而抗凝活很低的肝素寡糖。但是，这些方法中所用到的肝素酶需要经过多步的纯化步骤，收率较低，造成酶的成本非常昂贵(肝素黄肝菌产生的商品肝素酶的价格为40美元/U)，限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)，是具有序列表中的SEQ ID N1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的序列1由756个氨基酸残基组成。所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)可按照以下方法制备将pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)；所述pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白(MBP-hepA)编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。序列2中的DNA序列由2271个脱氧核苷酸组成，该基因的编码序列为自5’端第1到第2271位脱氧核苷酸。所述肝素可从商业途径获得，也可按照现有的方法合成。所述肝素的初始浓度为1-100g/l，优选为25g/l。用于溶解所述肝素的溶剂可为含3.5mM Ca(CH3COO)2和0.05％NaN3的pH为6.5-8.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液。所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量为1.875-187.5IU/g底物，优选为7.5IU/g底物。所述方法中，反应温度可为10-45℃，优选为15-20℃。所述方法中，反应时间为6-12小时。反应时间优选为9-12小时；尤其优选为9小时。所述方法中，可按照以下方法纯化低分子量肝素终止反应后将混合物进行截留分子量为10000Da的超滤，将得到的滤液利用TSK-GEL G2000SW柱进行凝胶过滤层析，收集保留时间为18-20分钟的洗脱峰，得到低分子量肝素；所述凝胶过滤层析中所用的缓冲液为含质量百分含量为0.05％的NaN3，pH为7.0浓度为0.1M的NH4COOCH3缓冲液，所述缓冲液的流速为0.5ml/min。本专利技术的方法采用具有较高酶活的麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备肝素，由于麦芽糖结合蛋白具有和麦芽糖亲和吸附的能力，因此重组表达MBP-HepA有利于肝素酶的分离纯化，一步纯化就可以得到纯度为95％左右的MBP-HepA，从而可以大大降低酶的分离纯化成本；利用麦芽糖结合蛋白(MBP)的亲和吸附能力，可以很容易实现肝素酶I的定向固定化，使酶的反复使用成为可能，从而提高酶反应效率，降低酶的使用成本；从而降低低分子量肝素的生产成本。本专利技术通过控制酶解反应时间，得到了分子量分布范围窄的低分子量肝素(平均分子量在5000-6000)。由于MBP-HepA的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度的降低，因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。附图说明图1为表达载体pMal-hepA的构建过程示意2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱图3为凝胶色谱中分子量与停留时间的标准曲线4为MBP-HepA降解肝素6小时所得肝素寡糖的凝胶色谱5为MBP-HepA降解肝素9小时所得肝素寡糖的凝胶色谱6为MBP-HepA降解肝素0.5小时所得肝素寡糖的凝胶色谱图具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用麦芽糖结合蛋白－肝素酶Ⅰ融合蛋白降解肝素，得到低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白－肝素酶Ⅰ融合蛋白，是具有序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，况莹，陈银，罗明芳，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]