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一种表达载体及其应用制造技术

技术编号:1742138 阅读:170 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开了一种表达载体及其应用。其目的是提供一种可调控宿主细胞裂解的表达载体及利用该载体生产外源蛋白的方法。所述表达载体是在启动子下游含有S  RRz基因的表达质粒。利用该表达载体生产外源蛋白的方法,是先将外源基因插入上述表达载体得到外源基因表达载体,再将该外源基因表达载体导入宿主细胞,表达裂解细胞得到外源蛋白。本发明专利技术巧妙地构建了可调控宿主细胞壁裂解的表达载体,在生产过程中可实现宿主细胞的可控裂解破壁,即当目的蛋白(特别是GL-7-ACA酰化酶)大量积累后采用生物方法破壁,既可简化外源蛋白的分离纯化步骤,又可减少化学试剂的使用量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达载体及其应用,特别是涉及一种表达载体及利用该载体生产外源蛋白的方法。
技术介绍
目前,7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)是半合成头孢菌素的重要原料。7-ACA主要由头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)通过酶法或传统的化学法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点,与传统的化学法相比具有较大的竞争优势,因而用酶法裂解头孢菌素C生产7-ACA以成趋势。用酶法裂解生产7-ACA,分为一步酶法和两步酶法(图1)一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化头孢菌素C,脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链,生成7-ACA,虽然该法步骤简单,但目前已知的CPC酰化酶的酶活较低,无法满足工业催化的需要;两步酶法是利用来源不同的两种酶进行两步催化反应,首先,头孢菌素C在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase,DAAO)的作用下,生成一个具有酮基的中间体,此中间体较不稳定,易被同时生成的H2O2氧化为戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid,GL-7-ACA),然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链,生成7-ACA。产生GL-7-ACA酰化酶的菌株大多为假单胞菌(Pseudomonas sp.),可把具有催化GL-7-ACA生成7-ACA活性的酶分为5类,同类酶的基因都具有95%以上的同源性,且酶学性质几乎完全相同。随着生物技术的发展,人们越来越重视用基因工程的方法来生产酶和改造酶。罗晖等(罗晖等,产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达,微生物学通报,2004,31(4),38-42)使用了一种快速获取基因的方法,经过微生物选择性培养和特异性PCR扩增的方法从自然界中快速获取了GL-7-ACA酰化酶基因,并构建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-Acy,实现了GL-7-ACA酰化酶的克隆与表达。在用GL-7-ACA酰化酶催化GL-7-ACA生产7-ACA的研究中,人们通常是先对菌株进行培养和表达,然后进行酶的分离纯化和酶的固定化,最后将固定化酶与DAAO固定化酶混合起来一步催化CPC或分两步进行催化。长久以来,人们研究的重点都集中在提高酶的活力和稳定性上,而对酶的提取工艺和催化工艺进行改进的研究相对较少。噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体。烈性噬菌体感染细胞后可立即在宿主细胞内开始自身的生命循环,引起细胞的裂解;温和噬菌体感染细胞后,细菌可不被裂解而继续生长繁殖,成为溶源性细菌。在溶源性细菌中,噬菌体的DNA被整合到细菌的染色体上,与细菌的染色体一起复制,且随细胞的分裂传给子代细胞,使其子代细胞也成为溶源性细胞。当需要细胞裂解时,可通过改变外界环境条件如紫外照射、提高环境温度或添加化学试剂等来诱导宿主细胞,使噬菌体的DNA从宿主细胞的染色体上脱落下来,并在细胞内独立复制,开始自身的生命循环,从而达到裂解宿主细胞的作用。将噬菌体的DNA整合到E.coli的染色体上以获得溶源菌,利用溶源菌中的噬菌体来破细胞壁,使胞内积累的蛋白质释放的破壁方法具有破壁效率高、可控、操作条件温和等优点,具有潜在的应用价值。在研究感染了λ噬菌体的E.coli的裂解时发现,对细胞起裂解作用的主要是λ噬菌体DNA上裂解基因所编码的酶。λ噬菌体的裂解基因包括S、R和Rz三个基因,其中R基因的表达产物是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase),可分解细胞壁的肽聚糖。该酶与真正的溶菌酶的不同之处在于它可以引起肽键水解,而溶菌酶却只使肽聚糖上相邻的N-乙酰氨基葡萄糖残基间裂开。Rz基因表达产物可能是一种肽链内切酶(endopeptidase),它可以切割肽聚糖的寡糖之间和/或肽聚糖与细胞壁外膜之间的交联。R和Rz基因表达产物的功能是降解细胞壁,而S基因表达产物的作用是改变细胞质膜的通透性,在细胞质膜上形成多孔的结构,以使R和Rz基因表达产物穿过细胞质膜到达细胞壁,从而作用于细胞壁。当用含有琥珀突变缺陷型S基因的裂解基因S-RRz代替SRRz时,在诱导S-RRz表达后,细胞不被裂解而继续正常生长,并且可以在细胞内持续积累基因R和Rz表达产生的酶。但是,当在诱导表达后的细胞培养液中加入2%(v/v)CH3Cl,或将诱导表达后的细胞经冻融处理,则可以使细胞裂解。根据前面对S、R和Rz三个基因的表达产物在细胞裂解中不同作用的分析,认为此时细胞的裂解是依赖S基因的。加入CH3Cl和冻融处理的作用相当于S基因表达产物的功能,即破坏细胞质膜,让R和Rz产生的酶到达细胞的肽聚糖层。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可调控宿主细胞裂解的表达载体。本专利技术所提供的表达载体是在启动子下游含有S-RRz基因的表达质粒。所述S-RRz基因可具有序列表中序列2的核苷酸序列。其中,用于构建所述表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体,如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等;优选为pET28a。由本专利技术的表达载体构建的外源蛋白表达载体、细胞系及工程菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了利用该表达载体生产外源蛋白的方法。本专利技术所提供的生产外源蛋白的方法,是先将外源基因插入上述表达载体得到外源基因表达载体,再将该外源基因表达载体导入宿主细胞,表达并裂解细胞得到外源蛋白。所述外源蛋白优选为GL-7-ACA酰化酶。其中,用于构建所述表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体,如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等;优选为pET28a。所述GL-7-ACA酰化酶基因表达载体为pET-AS。所述GL-7-ACA酰化酶基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。所述裂解细胞的方法可为下述三种方法中的任意一种1)用2mmol/L EDTA重悬细胞,在37℃裂解20-40min;2)用pH8.0,0.1mol/L Tris-HCl缓冲液重悬细胞,在-30℃30min,37℃5min条件下进行一次冻融;3)用1mol/L NaOH溶液调节细胞悬液pH值至8-10,裂解20-40min。被导入所述GL-7-ACA酰化酶基因表达载体的宿主细胞的发酵培养基和发酵条件与其相应的宿主细胞相同。所述宿主可为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等,优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌优选为E.coli BL21(DE3)。本专利技术的表达载体用S-RRz代替SRRz,在利用该表达载体生产外源蛋白的过程中通过Tris-HCl、EDTA和NaOH处理模拟S基因的作用来改变细胞膜的通透性,使R和Rz基因产生的酶可以穿过细胞质膜到达细胞壁,裂解细胞壁,从而有望解决细胞培养时产品积累量最大与细胞裂解效率最高的矛盾。本专利技术巧妙地构建了可调控宿主细胞壁裂解的表达载体,在生产过程中可实现宿主细胞的可控裂解破壁,即当目的蛋白(特别是GL-7-ACA酰化酶)大量积累后采用生物方法破壁,既可简化外源蛋白的分离纯化步骤,又可减少化学试剂的使用量。附图本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种表达载体,是在启动子下游含有SRRz基因的表达质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:周航于慧敏罗晖沈忠耀
申请(专利权)人:清华大学
类型:发明
国别省市:11[中国|北京]

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