BRAF基因突变检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种BRAF基因突变检测体系及其试剂盒，试剂盒包括PCR检测液和SYBR GreenI混合液；PCR检测液包括用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上下游引物和肽核酸；肽核酸的核苷酸序列与BRAF野生型基因第600密码子V600E位点完全互补。本发明专利技术的BRAF基因突变检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行BRAF基因突变检测。

BRAF gene mutation detection system and its kit

The present invention relates to a BRAF gene mutation detection system and kit kit, including PCR and SYBR GreenI detection liquid mixture; PCR detection solution includes detection of BRAF gene codon 600th V600E loci primers and peptide nucleic acid; and nucleotide sequences of the wild-type BRAF gene codon 600th V600E loci of peptide nucleic acid completely complementary. The BRAF gene mutation detection system and its kit has high sensitivity and specificity, and less sample demand. It can detect BRAF gene mutation quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
BRAF基因突变检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测BRAF基因突变的方法和检测产品，属于生物

技术介绍
BRAF基因位于染色体7q34，是人类最重要的原癌基因之一，编码一种丝/苏氨酸激酶，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。研究表明，在恶性黑色肿瘤、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在不同比率的BRAF基因突变，其中约82％突变位于外显子15第1799核苷酸上，T突变为A(T1799A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)，该突变使BRAF蛋白激活导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。BRAF基因突变多见于黑素瘤患者，中国黑色素瘤患者BRAFV600E突变率约为26％，白种人约为50％，BRAFV600E突变患者对于激酶抑制剂类药物治疗有效，对该类药物使用具有重要的指导意义。有研究证明，野生型KRAS肿瘤当中，发生BRAFV600E突变的个体，对EGFR抑制剂类药物疗效减弱或无效，而没发生BRAF突变的野生型个体，32％有反应，68％没反应。这提示今后重点检测BRAF的突变可为今后结肠癌临床用药给予指导，BRAF基因突变的患者接受EGFR-TKI药物治疗的有效率低，BRAFV600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此检测肿瘤患者BRAF基因突变情况可用于指导EGFR-TKI的靶向用药。同时，BRAF基因也可作为患者预后评价的独立性指标，BRAFV600E突变患者呈现预后更差的趋势。目前对人类BRAF基因突变检测主要采用一代测序、FLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、等位基因特异的PCR和基因芯片等技术，但是操作过程繁琐，需要更换反应管而易发生污染，多需要电泳和多步后处理，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。因此，开发一种检测BRAF基因突变的产品，以实现更高灵敏度、更低成本、更方便快捷的BRAF基因突变检测是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行BRAF基因突变检测的BRAF基因突变检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种BRAF基因突变检测体系，包括用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上下游引物，荧光染料SYBRGreenI，以及肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述肽核酸的核苷酸序列与BRAF野生型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。上述上下游引物进行了LNA修饰。上述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L。上述上游引物在反应体系中的最终浓度为0.22μM/L，所述下游引物在反应体系中的最终浓度为0.17μM/L。上述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。上述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1.1μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述的检测体系的BRAF基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种BRAF基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液和SYBRGreenI混合液；所述PCR检测液包括用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸的核苷酸序列与BRAF野生型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。上述上下游引物进行了LNA修饰；所述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。上述BRAF基因突变检测试剂盒，还包括阳性对照A、阳性对照B和阴性对照；所述阳性对照液A是浓度为100ng/μL的包含BRAF基因第600密码子V600E位点的野生型质粒溶液；所述阳性对照液B是浓度为100ng/μL的包含BRAF基因第600密码子V600E位点的突变型质粒溶液；所述阴性对照液是不含野生型、突变型BRAF基因的基因组DNA溶液。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术采用PNA钳制实时定量PCR检测法，仅需1对引物和1条PNA，通过熔解曲线分析，即可将BRAF基因突变型与野生型区分开。通过一步反应，可解决PCR扩增、突变富集及定量整个过程，无需诸如电泳、杂交、酶切等后续步骤，大大简化了实验过程，整个反应过程在密封管内完成，最大限度地减少了污染的可能，降低假阳性率。(2)本专利技术的BRAF基因突变检测方法及其试剂盒，仅需一对引物和一条肽核酸便可检测第600密码子V600E突变，灵敏度高。灵敏度可达到0.1％～0.5％，与常规PCR的浓度相比，本专利技术容易地检测出非常低浓度样本的BRAF基因突变状态，克服了TaqMan探针法需要使用特异性探针进行检测的缺点，满足大样本量临床筛查的要求。(3)本专利技术选择SYBRGreenI作为荧光染料，价格低廉，大大降低检测成本。附图说明图1采用实施例的试剂盒检测阳性对照A的BRAF基因野生型特异性产物峰Tm值。图2是采用实施例的试剂盒检测阳性对照B的BRAF基因突变型特异性产物峰Tm值。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。一、试剂盒的组成。本实施例的BRAF基因突变检测试剂盒，包括PCR检测液、SYBRGreenI混合液、阴性对照、阳性对照A和阳性对照B。试剂盒各成分如表1所示。表1试剂盒成分表成分分装组成PCR检测液1管BRAF基因引物、肽核酸SYBRGreenI混合液1管——阳性对照A1管含野生型BRAF基因的质粒阳性对照B1管含突变型BRAF基因的质粒阴性对照1管不含BRAF基因的基因组DNA溶液上述表1中试剂盒组分的说明如下：1)SYBRGreenI混合液的主要成分包括DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、SYBRGreenI、缓冲液等(由Bioer公司提供，货号：B255l1)。2)PCR检测液包括:用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上下游引物和与野生型BRAF基因完全互补的肽核酸。本实施例对上下游引物进行了LNA修饰。即在寡核苷酸链中引入一个LNA碱基，并通过调整LNA碱基在引物中的位置来调节最佳熔点(Tm)和杂交的特异性。经过修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BRAF基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上下游引物，荧光染料SYBRGreen

【技术特征摘要】
1.一种BRAF基因突变检测体系，其特征在于：包括用于检测BRAF基因第600密码子V600E位点的上下游引物，荧光染料SYBRGreen，以及肽核酸；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述肽核酸的核苷酸序列与BRAF野生型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物进行了LNA修饰。3.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测体系，其特征在于：所述上下游引物在反应体系中的最终浓度为0.1～0.3μM/L。4.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测体系，其特征在于：所述上游引物在反应体系中的最终浓度为0.22μM/L，所述下游引物在反应体系中的最终浓度为0.17μM/L。5.根据权利要求1所述的BRAF基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1～1.5μM/L。6.根据权利要求5所述的BRAF基因突变检测体系，其特征在于：所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1.1μM/L。7.一种采用如权利要求1所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31