一种提取微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的方法。该方法包括以下步骤：１）发酵产聚羟基脂肪酸酯的微生物菌株后，收集发酵液中的菌体细胞；２）向步骤１）收集的湿菌体或将其干燥后制成的菌体粉末中加入与聚羟基脂肪酸酯单体结构相似的酯类有机溶剂，混匀，在８０－１２０℃下加热１－４小时提取聚羟基脂肪酸酯；３）分离除去菌体残渣，保留有机相；４）用与步骤２）所用的酯类提取溶剂互溶的有机溶剂将聚羟基脂肪酸酯从步骤３）获得的有机相中沉淀出来；５）分离、洗涤沉淀；６）将沉淀干燥后，得到聚羟基脂肪酸酯。将本发明专利技术的方法应用于高纯度ＰＨＡ的工业化生产，不仅可缩短生产时间，减少能耗、生产设备投资以及生产过程对环境的污染，而且可提高生产过程中的安全性，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
聚羟基脂肪酸酯(Poly-β-Hydroxyalkanoates，简称PHA)是由微生物合成的一种胞内聚酯，在微生物胞内以颗粒状的内含物形式存在。PHA的物理性能与石油化工来源的塑料相似，且具有生物可降解性能，被认为是一种具有潜力的“生物可降解塑料”；目前，组织工程领域的研究表明PHA材料具有良好的生物相容性，是非常有潜力的组织工程材料。PHA以内含物的形式存在于微生物体内，根据PHA单体(结构通式见式1，R1、R2可以是不同取代基团。典型的R1、R2基团的结构为CH3、(CH2)nCH3(n＝1-8))组成的不同，分为短链PHA(单体的碳链长度3-5，如聚3-羟基丁酸酯PHB，3-羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV)，中长链PHA(单体碳链长度不小于6)，短链中长链共聚PHA(既有长度3-5的单体，又含有碳链长度不小于6的单体，如3-羟基丁酸己酸共聚酯PHBHHx)。这三种PHA的物理性能差异很大。已有的下游后处理PHA提取工艺，常用的提取或破壁试剂有氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等，也有通过次氯酸钠处理裂解细胞后再用有机溶剂进行抽提，还有通过降解微生物内非聚羟基脂肪酸酯成分以达到提纯的目的。但是上述提取方法都存在较大缺陷，如回收率不高、产品纯度低、提取后产品分子量降低等，加上使用的许多有机溶剂毒性较大，沸点较低，提取过程需要高压，给生产带来安全隐患。对于中长链的PHA，现有的提取方法通常得到PHA沉淀是粘性很大的物质，较难分离和干燥，给提取带来一定的困难，而且纯度较低，带有较多杂质，限制了其在医学领域中的应用。 式1
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种较简便、快速、提取率较高的微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的提取方法。本专利技术所提供的提取微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的方法，包括以下步骤1)发酵产聚羟基脂肪酸酯的微生物菌株，收集发酵液中的菌体细胞； 2)向步骤1)收集的湿菌体或将其干燥后制成的菌体粉末中加入与聚羟基脂肪酸酯单体结构相似的酯类有机溶剂，混匀，在80-120℃下加热1-4小时提取聚羟基脂肪酸酯；所述与聚羟基脂肪酸酯单体结构相似的酯类有机溶剂为乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸戊酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯中的一种或几种的混合溶剂；3)分离除去菌体残渣，保留有机相；4)用与步骤2)所用的酯类提取溶剂互溶的有机溶剂将聚羟基脂肪酸酯从步骤3)获得的有机相中沉淀出来；所述用于沉淀聚羟基脂肪酸酯的有机溶剂与有机相的体积比为3-15∶1；5)分离、洗涤沉淀；6)将沉淀干燥后，得到聚羟基脂肪酸酯。在上述提取方法中，步骤1)中产聚羟基脂肪酸酯的微生物菌株的选择是任意的，如Aeromonas hydrophila 4AK4、E.coli JM109(pBHR68)、Wautersia eutropha H16或Pseudomonas putida KT2442等，可按产聚羟基脂肪酸酯的微生物菌株的常规培养条件对其进行发酵。步骤2)中湿菌体与酯类有机溶剂的重量/体积比为1∶1-5，干菌体与酯类有机溶剂的重量/体积比为1∶3-15；当直接用湿菌体提取聚羟基脂肪酸酯时，为避免加入提取溶剂后水相的湿菌体与提取溶剂难以混合均匀，可先将湿菌体与无水乙醇或/和丙酮混合均匀，再加入提取溶剂进行提取；此外，为获得更高的提取效率，从菌体细胞中提取聚羟基脂肪酸酯的过程优选为在搅拌条件下进行，搅拌的速度可为100-200转/分钟，优选为150转/分钟。步骤4)中用于沉淀聚羟基脂肪酸酯的有机溶剂可为90-100％(V/V)乙醇、正己烷或丙酮。步骤5)中的洗涤溶剂可为无水乙醇。步骤6)中对沉淀进行干燥的条件可为在45-55℃下真空加热3-5小时，优选为在50℃下真空加热4小时。在上述方法中，步骤3)-5)从液固混合物中分离固体沉淀的方法均为离心或过滤。本专利技术提供了。该方法具有以下优点1)采用具有与PHA单体相似结构的酯类有机溶剂作为PHA提取溶剂，如乙酸正丁酯、丁酸乙酯等，对于PHA具有很好的溶解性；2)所用PHA提取溶剂是具有水果香味的工业常用试剂，不仅廉价，而且毒性很低，沸点较高，均为100℃以上，从而可以实现常压下直接从湿菌体或干燥的菌体中提取PHA；3)对生产设备的要求较低；4)对于各种类别的PHA均有很好的提取效果，提取率可达68-91％，并可获得纯度较高的PHA产品，提取过程对产品的分子量没有影响。基于上述优点，将本专利技术的方法应用于高纯度PHA的工业化生产，不仅可缩短生产时间，减少能耗、生产设备投资以及生产过程对环境的污染，而且可提高生产过程中的安全性，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，其中微生物胞内聚羟基脂肪酸酯(PHA)的提取率根据下式计算 实施例1、提取Aeromonas hydrophila 4AK4胞内聚羟基脂肪酸酯现使用乙酸正丁酯从Aeromonas hydrophila 4AK4(Chen GQ，G.Zhang，S.J.Park，S.Y.Lee，Industrial scale Production of Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate).Appl Microbiol Biotechnol，57(2001)5750-55)的干菌体中提取短链中长链共聚PHA(PHBHHx)，其中破壁提取溶剂乙酸正丁酯的结构式如下 式2具体的提取过程包括以下步骤1)称量经发酵的Aeromonas hydrophila 4AK4干菌体粉末20g；2)加入100mL乙酸正丁酯，混匀，在150转/分钟下搅拌，并在110℃下回流加热处理1小时；3)5000g离心10分钟，除去细菌残渣，留上清；4)向上清液中加入500mL 95％(v/v)酒精，混合均匀，静置30分钟，有白色絮状或粉末状沉淀析出；5)5000g离心2分钟，收集沉淀，对其用50mL无水乙醇浸泡洗涤10分钟，5000g离心5分钟收集沉淀；6)将经洗涤的沉淀在50℃下真空干燥4小时，得到PHA产品。经检测，用上述方法得到的PHA产品纯度为96％，提取率为90％，重均分子量为480000道尔顿，符合标准。实施例2、提取Aeromonas hydrophila 4AK4胞内聚羟基脂肪酸酯现使用乙酸正丁酯与乙酸异丁酯的混合溶剂从Aeromonas hydrophila 4AK4的干菌体中提取短链中长链共聚PHA(PHBHHx)，其中破壁提取溶剂中的乙酸异丁酯的结构式如下 式3具体的提取过程包括以下步骤1)称量经发酵的Aeromonas hydrophila 4AK4干菌体粉末20g；2)加入60mL乙酸正丁酯与乙酸异丁酯混合溶剂(体积比1∶1)，混匀，在200转/分钟下搅拌，并在110℃下回流加热处理1小时；3)5000g离心10分钟，除去细菌残渣，留上清；4)向上清液中加入900mL 95％(v/v)酒精，混合均匀，静置30分钟，有白色絮状或粉末状沉淀析出；5)5000g离心2分钟，收集沉淀，对其用60mL无水乙醇浸泡洗涤10分钟，5000g离心5分钟收集沉淀；6)将经洗涤的沉淀在50℃下真空干燥4.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取微生物胞内聚羟基脂肪酸酯的方法，包括以下步骤：１）发酵产聚羟基脂肪酸酯的微生物菌株后，收集发酵液中的菌体细胞；２）向步骤１）收集的湿菌体或将其干燥后制成的菌体粉末中加入与聚羟基脂肪酸酯单体结构相似的酯类有机溶剂，混匀，在８０－１２０℃下加热１－４小时提取聚羟基脂肪酸酯；所述与聚羟基脂肪酸酯单体结构相似的酯类有机溶剂为乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸戊酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯中的一种或几种的混合溶剂；３）分离除去菌体残渣，保留有机相；４）用与步骤２）所用的酯类提取溶剂互溶的有机溶剂将聚羟基脂肪酸酯从步骤３）获得的有机相中沉淀出来；所述用于沉淀聚羟基脂肪酸酯酯的有机溶剂与有机相的体积比为３－１５∶１；５）分离、洗涤沉淀；６）将沉淀干燥后，得到聚羟基脂肪酸酯。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，欧阳少平，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]