本发明专利技术公开了一种紫杉醇的生物合成方法及其专用培养基。该培养基的配方为：ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２００－３００ｍｇ，ＫＮＯ↓［３］２００－３００ｍｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］３５０－４００ｍｇ，Ｃａ（ＮＯ↓［３］）↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ４５０－５５０ｍｇ，ＦｅＳＯ↓［４］２７－２９ｍｇ，Ｃ↓［１０］Ｈ↓［１４］Ｎ↓［２］Ｏ↓［８］Ｎａ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ３６－３８ｍｇ，ＭｎＳＯ↓［４］.Ｈ↓［２］Ｏ０．８－１．２ｍｇ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．４－０．６ｍｇ，ＫＩ０．２－０．３ｍｇ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．０２－０．０３ｍｇ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］０．２－０．３ｍｇ，盐酸噻胺８－１２ｍｇ，Ｃｈｏｌｉｎｅ０．４－０．６ｍｇ，Ｌ－半胱氨酸８－１２ｍｇ，Ｈ↓［２］ＮＣＯＮＨ↓［２］１８０－２２０ｍｇ，Ｉｎｏｓｉｔｏｌ８０－１２０ｍｇ，６－苄基腺嘌呤０．１－１ｍｇ／Ｌ，α－萘乙酸０．５－１．５ｍｇ／Ｌ，蔗糖或葡萄糖２０－５０ｇ／Ｌ，麦芽糖２０－５０ｇ／Ｌ，组合前体物质，组合代谢调节物质和组合诱导子，用水定容至１Ｌ，ｐＨ５．６－５．８。本发明专利技术将在紫杉醇的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域中的天然产物的生物合成方法及其专用培养基，特别是涉及紫杉醇的生物合成方法及其专用培养基。
技术介绍
紫杉醇(pacilitaxel，商品名taxol)，是1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫杉(短叶红豆杉，Taxus.brevifolia)树皮中提取出来的具有独特抗癌活性的二萜类化合物。用该化合物制备的药物于1990年进入III期临床试验，1992年底获美国FDA批准上市，用于治疗对常规化疗无效的卵巢癌和乳腺癌。1995年，我国北京协和药厂与海口制药厂分获二类新药批准文号，成为世界上第二个生产紫杉醇及其注射液的国家。由于紫杉醇具有独特的抗癌机理和广谱高效的抗癌活性，现已成为继阿霉素和顺铂后最常用的抗癌药物。紫杉醇是一种高效的细胞毒素，具有独特的抗癌机理。研究表明，紫杉醇作用于微管蛋白。微管是真核细胞的一种纤维蛋白，与细胞的有丝分裂紧密相关，紫杉醇可诱导和促进微管蛋白迅速聚合形成对热与钙稳定的微管，并以非共价键化学计量地与聚合微管结合。这样，对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇可“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。此外，紫杉醇还表现出广谱而高效的抗癌活性，对人的卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、CNS癌、黑色素瘤、肝癌和白血病细胞系等均可产生细胞毒作用；其抗癌活性高于噻唑呋啉、顺铂、依托泊甙、阿霉素和氟尿嘧啶等常用抗癌药物。紫杉又名红豆杉，是红豆杉属植物，据统计，全世界有11种红豆杉属植物，且生长缓慢，种群密度小，自身繁殖率低。紫杉醇多提取自紫杉的树皮或树叶，且天然的植物中紫杉醇的含量极低，只有0.003-0.006％，其中，含量最高的曼地亚红豆杉(杂交种)也仅为约0.01％左右。目前，全世界紫杉醇的产量只有350公斤左右，受产量限制，该药只能用于其它药物无效的癌症治疗。据估计，全世界每年的紫杉醇需求量至少约为1000kg，而目前紫杉醇的产量远远不能满足市场需求。因此，采用各种手段寻找紫杉醇及其类似物的替代资源已成为近年来全世界的研究热点。美国农业部于1991年就批准了Christen和Gibson等用细胞培养法生产紫杉醇及其类似物的专利(United States Patent 5,019,504.)，但是因其存在细胞增殖缓慢，紫杉醇含量低以及大规模培养工艺复杂等问题，一直没有实现产业化生产。因此该领域的研究仍方兴未艾，相关的研究机构和研究人员一直有增无减。
技术实现思路
本专利技术的目的是一种用于生物合成紫杉醇的培养基。本专利技术所提供的培养基，命名为紫杉醇合成培养基，其配方为MgSO4·7H2O200-300mg，KNO3200-300mg，KH2PO4350-400mg，Ca(NO3)2·4H2O 450-550mg，FeSO427-29mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 36-38mg，MnSO4·H2O 0.8-1.2mg，ZnSO4·7H2O 0.4-0.6mg，KI 0.2-0.3mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO30.2-0.3mg，盐酸噻胺(Aneurinehydrochloride)8-12mg，氯化胆碱(Choline)0.4-0.6mg，L-半胱氨酸(L-Cysteine)8-12mg，H2NCONH2180-220mg，肌醇(Inositol)80-120mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.1-1mg/L，α-萘乙酸(NAA)0.5-1.5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-50g/L，麦芽糖20-50g/L，组合前体物质，组合代谢调节物质和组合诱导子，用水定容至1L，pH5.6-5.8；所述组合前体物质由100-150mL/L番茄汁，10-30mL/L丙酮酸，20-40mL/L苯甲酸，40-50mL/L β-苯丙氨酸和30-50μl/L乙酸酐组成；组合代谢调节物质由5-20mL/L鸟氨酸，20-40mL/L色氨酸，100-150mL/L谷氨酰胺和1-3mL/L辅酶A组成；组合诱导子由0.02-0.04M紫杉真菌诱导子F3，50-80μg/L水杨酸，30-50μl/L过氧化氢和80-100μmol/L甲基茉莉酮酸组成。上述紫杉醇合成培养基的配方优选为MgSO4·7H2O 250mg，KNO3250mg，KH2PO4375mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，FeSO427.8mg，C10H14N2O8Na2·2H2O 37.2mg，MnSO4·H2O1mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，KI 0.25mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，H3BO30.25mg，盐酸噻胺10mg，氯化胆碱0.5mg，L-半胱氨酸10mg，H2NCONH2200mg，肌醇100mg，6-苄基腺嘌呤0.1-1mg/L，α-萘乙酸0.5-1.5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-50g/L，麦芽糖20-50g/L，组合前体物质，组合代谢调节物质和组合诱导子，用水定容至1L，pH5.6-5.8；所述组合前体物质由100-150mL/L番茄汁，10-30mL/L丙酮酸，20-40mL/L苯甲酸，40-50mL/L β-苯丙氨酸和30-50μl/L乙酸酐组成；组合代谢调节物质由5-20mL/L鸟氨酸，20-40mL/L色氨酸，100-150mL/L谷氨酰胺和1-3mL/L辅酶A组成；组合诱导子由0.02-0.04M紫杉真菌诱导子F3，50-80μg/L水杨酸，30-50μl/L过氧化氢和80-100μmol/L甲基茉莉酮酸组成。本专利技术的第二个目的是提供一种产量较高，成本较低廉的紫杉醇的生物合成方法。本专利技术所提供的紫杉醇的生物合成方法，是将紫杉细胞接种于上述紫杉醇合成培养基中，在25-30℃、黑暗条件下振荡培养，收获细胞，再经萃取、纯化后得到紫杉醇。在上述紫杉醇的生物合成方法中，所述接种的紫杉细胞与紫杉醇合成培养基的重量份数比可为1-4∶10，振荡培养时的振速为80-120rpm，合成培养时间可为2-4天。所述紫杉细胞既可为东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb et Zucc)、中国红豆杉(Taxus chinensis)、南方红豆杉(T.mairei S.Y.Hu)、曼地亚红豆杉(T.media)或云南红豆杉(T.yunnanenisis Cheng et Fu)等任意品种的紫杉细胞，也可以用人工培养或商业途径购买的等任意来源的紫杉细胞，如用具有以下步骤的培养方法获得的高活性紫杉细胞1)以经表面杀菌的幼嫩枝条或叶片为外植体，切成小段后，将其接种于愈伤组织诱导培养基上在20-25℃、1500-3000LX、14-16小时光照/天条件下诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在上述紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1-5mg/L，α-萘乙酸0.1-5mg/L，蔗糖或葡萄糖20-50g/L，琼脂5-8g/L或冷凝胶(Gellan Gum)1.8-2g/L，pH 5.6-5.8；2)将愈伤组织接种于继代培养基上在20-25℃、避光条件下进行继代培养，并从中筛选出紫杉醇含量达到0.006％以上的初级高产细胞株；所述继代培养基是在紫杉基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤0.1-4mg/L本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于生物合成紫杉醇的培养基，其配方为：ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２００－３００ｍｇ，ＫＮＯ↓［３］２００－３００ｍｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］３５０－４００ｍｇ，Ｃａ（ＮＯ↓［３］）↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ４５０－５５０ｍｇ，ＦｅＳＯ↓［４］２７－２９ｍｇ，Ｃ↓［１０］Ｈ↓［１４］Ｎ↓［２］Ｏ↓［８］Ｎａ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ３６－３８ｍｇ，ＭｎＳＯ↓［４］.Ｈ↓［２］Ｏ０．８－１．２ｍｇ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ０．４－０．６ｍｇ，ＫＩ０．２－０．３ｍｇ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．０２－０．０３ｍｇ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］０．２－０．３ｍｇ，盐酸噻胺８－１２ｍｇ，氯化胆碱０．４－０．６ｍｇ，Ｌ－半胱氨酸８－１２ｍｇ，Ｈ↓［２］ＮＣＯＮＨ↓［２］１８０－２２０ｍｇ，肌醇８０－１２０ｍｇ，６－苄基腺嘌呤０．１－１ｍｇ／Ｌ，α－萘乙酸０．５－１．５ｍｇ／Ｌ，蔗糖或葡萄糖２０－５０ｇ／Ｌ，麦芽糖２０－５０ｇ／Ｌ，组合前体物质，组合代谢调节物质和组合诱导子，用水定容至１Ｌ，ｐＨ５．６－５．８；所述组合前体物质由１００－１５０ｍＬ／Ｌ番茄汁，１０－３０ｍＬ／Ｌ丙酮酸，２０－４０ｍＬ／Ｌ苯甲酸，４０－５０ｍＬ／Ｌβ－苯丙氨酸和３０－５０μｌ／Ｌ乙酸酐组成；组合代谢调节物质由５－２０ｍＬ／Ｌ鸟氨酸，２０－４０ｍＬ／Ｌ色氨酸，１００－１５０ｍＬ／Ｌ谷氨酰胺和１－３ｍＬ／Ｌ辅酶Ａ组成；组合诱导子由０．０２－０．０４Ｍ紫杉真菌诱导子Ｆ３，５０－８０μｇ／Ｌ水杨酸，３０－５０μｌ／Ｌ过氧化氢和８０－１００μｍｏｌ／Ｌ甲基茉莉酮酸组成。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭志刚，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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