一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。本发明专利技术制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力远高于现有疫苗等优点，较我国目前商品化的产气荚膜梭菌天然毒素灭活疫苗大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

A recombinant subunit vaccine of Clostridium perfringens epsilon toxin and its production method

The present invention relates to a recombinant subunit vaccine of Clostridium perfringens epsilon toxin and its production method. Clostridium perfringens epsilon toxin recombinant subunit vaccine prepared by the invention, the after codon optimization, containing 3 amino acid mutations of recombinant Clostridium perfringens epsilon toxin protein production, that is to maximize the retention of the integrity and conformation of natural toxins, so as to maintain its immunogenicity, and avoid a single amino acid mutation biological safety hidden trouble. The vaccine also has simple preparation process, low dosage, immune vaccine efficacy is much higher than the current vaccine and other advantages, is the commodity of Clostridium perfringens natural toxin inactivated vaccine greatly reduces the risk of biological safety vaccine production process, is an ideal candidate vaccine present of Clostridium perfringens type D toxin the upgrading of the vaccine; and in common with other vaccine antigen preparation, without increasing the dose of vaccine combined vaccine can be prepared.

【技术实现步骤摘要】
一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，该菌可产生至少18种外毒素，并通过其产生的毒素发挥致病作用。根据产生4种主要致死性外毒素α、β、ε和ι的种类，将该菌分为A、B、C、D、E五个毒素型。产气荚膜梭菌病具有发病急、病程短且死亡率极高的特点，一旦发病，往往还来不及治疗就因外毒素中毒而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前使用的商品化疫苗主要为灭活疫苗，在预防动物产气荚膜梭菌病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应等；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。ε毒素是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，全长296个氨基酸，以前毒素的形式分泌于菌体外。前毒素被宿主的胰蛋白酶和糜蛋白酶或梭菌自身的蛋白酶作用后，去除N端11-13个以及C端22-29个氨基酸，从而活化为成熟毒素。ε毒素属于β穿孔素家族成员，是产气荚膜梭菌毒素中毒力最强的毒素，其毒力仅次于肉毒杆菌素和破伤风神经毒素，是目前已知第三强的梭菌类毒素。因此，实现毒素的减毒甚至无毒以及构建相关减毒或无毒体，对于开发毒素基因工程亚单位疫苗以及其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用就显得尤为重要。现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。目前虽然已有产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体的报道，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于力等(“产气荚膜梭菌ε毒素减毒突变体及其应用”，申请号：201410707351.6)将野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素的第71位酪氨酸突变为非芳香族氨基酸，获得了对于细胞或动物体减毒的ε毒素突变体，由于该申请仅突变1个氨基酸，易发生回复突变而重新成为毒力极强的毒素，从而给未来实际的疫苗大规模生产带来严重的生物安全风险。中国动物疫病预防控制中心宋晓晖等(“抑制产气荚膜梭菌感染的重组ε蛋白及其制备方法与应用”，申请号：201610301989.9)设计了3种重组ε毒素蛋白，但均缺失了野生型ε毒素蛋白的前50个氨基酸残基，这种采用蛋白片段作为免疫原的策略，很可能会导致抗原蛋白的抗原性不完整，从而影响其免疫原性。本专利技术制备的产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，系采用经过密码子优化、含有3个氨基酸突变的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白生产，即最大限度地保留天然毒素蛋白的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该疫苗还具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，用于预防由B型和D型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠杆菌表达的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠杆菌被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.14652。2.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸。3.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。4.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白为无毒突变体，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。5.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性表达，既可最大限度地保留天然毒素蛋白的空间构象，从而保持其免疫原性；又避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了疫苗的制备时间和生产成本。6.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其C端含有6组氨酸(6His)标签，便于蛋白的纯化。7.本专利技术所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的制备方法，其特征在于用所述表达产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的埃希氏大肠菌BL21/mETX-HYY株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加双相油乳佐剂混合制成。本专利技术具体实施方式1.产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗的制备(1)菌种：制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，该菌种表达的产气荚膜梭菌ε毒素蛋白含有3个氨基酸突变(分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸)、C端含有6组氨酸(6His)标签。该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.14652；由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。(2)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。(3)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。(4)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，发酵罐内培养。设置培养参数为：培养温度3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/mETX‑HYY株，该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.14652。

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗含有采用大肠埃希氏菌表达的重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白；制苗用菌种为重组表达产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的大肠埃希氏菌，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BL21/mETX-HYY株，该菌株已于2017年09月21日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.14652。2.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，与野生型产气荚膜梭菌ε毒素成熟毒素相比，含有3个氨基酸突变，分别为第30位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸，以及第196位酪氨酸突变为丙氨酸。3.如权利要求1所述产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗，其特征在于所述重组产气荚膜梭菌ε毒素蛋白，其重组表达载体的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小云，杜吉革，朱真，薛麒，王磊，印春生，李启红，康凯，姚文生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11