一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法。利用PCR技术扩增类球红细菌Rhodobacter sphaeroides类胡萝卜素合成途径中的八氢番茄红素合成酶基因crtB，构建过量表达质粒DNA载体pRKpuf‑crtB，利用接合转移技术将质粒DNA表达载体转化到类球红细菌中获得过量表达crtB的基因工程菌，诱导表达crtB提高类球红细菌发酵生产类胡萝卜素的产量。本发明专利技术提供了一种增加类胡萝卜素产量的方法，能将类胡萝卜素的产量提高约284.0％，适合类胡萝卜素大规模工业化生产。

Construction of plasmid expressing vector for improving carotenoid yield of Rhodobacter like bacteria

The invention discloses a method for constructing a plasmid expressing carrier for improving the yield of carotenoid of rhodoid like bacteria. By PCR amplification of R.sphaeroides Rhodobacter sphaeroides carotenoid biosynthetic pathway in eight phytoene synthase gene crtB, constructed the over expression plasmid DNA pRKpuf crtB conjugation technology DNA plasmid expression vector was transformed into obtained overexpression gene engineering bacteria crtB of Rhodobacter sphaeroides, induced expression to improve the crtB of Rhodobacter sphaeroides fermentation for carotenoid production. The invention provides a method for increasing the yield of carotenoids, which can increase the yield of carotenoids by about 284%, and is suitable for large-scale industrialized production of carotenoids.

【技术实现步骤摘要】
一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法
本专利技术涉及一种生物表达载体，尤其涉及一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建。
技术介绍
类球红细菌广泛分布于淡水、海水、极地或温泉(包括高热水体)以及高盐、高有机质含量等不同的生态环境中，是一类进行不产氧光合作用，具有复杂代谢功能的微生物。类球红细菌是生产类胡萝卜素的最重要的微生物之一。然而，目前利用类球红细菌发酵生产类胡萝卜素的产量还比较低。类胡萝卜素是一种重要的食用色素，通常是指40碳的碳氢化合物(胡萝卜素)和它们的氧化衍生物(叶黄素)两大类色素的总称。能够增加机体免疫功能和细胞之间的缝间联接交流，具有抗氧化功能、抗癌功能等重要的功能，在医药和食品领域展现出了良好的应用前景，具有极其广阔的市场。本专利技术利用PCR技术扩增类球红细菌Rhodobactersphaeroides类胡萝卜素合成途径中的八氢番茄红素合成酶基因crtB，构建过量表达质粒DNA载体，利用接合转移技术将质粒DNA表达载体转化到类球红细菌中，优化诱导表达体系，得到高产类胡萝卜素的基因工程菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法，包括步骤：(1)类球红细菌基因组DNA的提取；(2)八氢番茄红素合成酶基因crtB的PCR扩增；(3)crtB基因过量表达载体pRKpuf-crtB的构建；(4)利用S17-1将表达载体pRKpuf-crtB接合转移到类球红细菌中获得基因工程菌；(5)利用基因工程菌诱导表达类胡萝卜素并进行定量分析。进一步的，步骤(2)中，所述crtB基因序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，用于扩增crtB基因引物序列为：crtB-F:5'gctctagaATTGCCTCTGCCGATCTC3'crtB-R：5'ggaattcCTAGATCGGGTTGGCCC3'；扩增条件为：第一阶段98℃预变性10秒；第二阶段62.5℃退火5秒，72℃延伸1分10秒，循环30次。本专利技术的有益技术效果是：利用基因工程手段过量表达类球红细菌类胡萝卜素合成途径中的八氢番茄红素合成酶基因crtB以进一步提高类胡萝卜素的产量。同时类球红细菌本身安全、营养丰富、易于培养、类胡萝卜素含量丰富、操作简单。在经过上述步骤构建的表达载体提高类胡萝卜素产量的过程中，也避免了化学试剂的使用，安全无毒害。并且相比现有用于生产类胡萝卜素的类球红细菌，该工程菌具有更高的类胡萝卜素生产能力。该专利技术由于微生物发酵生产类胡萝卜素的过程中，类胡萝卜素的产量提高了约284.0％，具有较高的应用价值和工业实用性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为以类球红细菌基因组DNA为模板扩增crtB的PCR图；图2为pRKpuf-crtB的菌落PCR验证图；图3为原始类球红细菌、只含pRKpuf的转化菌、含crtB基因的转化菌提取类胡萝卜素的产量图；图4为本专利技术的步骤示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。材料：1.PrimeSTARTMHSDNA聚合酶(Takara公司产品，中国大连)2.各种限制性内切酶(Takara公司产品，中国大连)3.连接试剂盒DNALigationKitVer.2.0(Takara公司产品，中国大连)4.DNA纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代公司产品，中国北京)5.DNA提取试剂盒UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(Takara公司产品，中国大连)6.大肠杆菌S17-1(实验室保存)7.大肠杆菌DH5α(实验室保存)8.类球红细菌Rhodobactersphaeroides(实验室保存)注：以下试剂均为市售产品。9.LB培养基酵母提取物5g胰蛋白胨10gNaCl10g固体培养基：加入2％(w/v)琼脂粉溶于1000mL去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸汽灭菌。培养基(1L)1L超纯H2O溶解注意：用NaOH调节pH至6.90，121℃、15分钟湿热灭菌，灭菌后与20ml50xPhosphate-Solution和8mlVitamine-Solution混匀使用。TraceMetalSolution1L超纯H2O溶解注意：称取柠檬酸铁于盛有适量超纯水的锥形瓶中，微波炉加热溶解，然后冷却至室温，然后加其他微量元素。4℃、黑暗条件下储存。50xPhosphateSolutionK2HPO445gKH2PO430g1L超纯H2O溶解注意：根据用量配制，121℃、灭菌15min。VitamineSolution1L超纯H2O溶解注意：过滤灭菌，4℃保存。固体培养基按16g/L加琼脂粉。实施例1类球红细菌产类胡萝卜素关键酶基因crtB的PCR扩增和连接按照DNA提取试剂盒的操作说明，从类球红细菌Rhodactersphaeroides中提取基因组DNA，根据GenBank上报道的类球红细菌基因序列设计一对PCR引物crtB-F和crtB-R，上游引物crtB-F的5′端含有酶切位点XbaI，下游引物crtB-R的5′端含有酶切位点EcoRI，引物序列如下：crtB-F:5'gctctagaATTGCCTCTGCCGATCTC3'crtB-R：5'ggaattcCTAGATCGGGTTGGCCC3'PCR的反应体系为50μL，其中含引物crtB-F和crtB-R各1μL，4μL的dNTP，1μL基因组DNA，2×PrimeSTARTM反应缓冲液25μL，高保真的PrimeSTARTMHSDNA聚合酶0.5μL。PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性10秒；第二阶段62.5℃退火5秒，72℃延伸1分10秒，循环30次。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1000bp大小电泳带(图1)，将PCR产物过柱纯化(参照试剂盒说明书)。取适量回收PCR产物先与pMD18-T载体进行连接，连接体系为：0.75μLpMD18-T载体，4.3μLPCR回收产物，5μLSolutionI，在16℃恒温水浴锅中进行过夜连接。连接产物通过CaCl2转化法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞(参照分子克隆实验指南：用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌)，经5mg/mL四环素抗性筛选后，常规菌落PCR(M13通用引物)进行验证，将PCR验证正确的样品进行测序确认，质粒命名为pMD18-T-crtB。实施例2pRKpuf-crtB表达载体的构建取测序正确的pMD18-T-crtB质粒，用EcoRI和XbaI进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤为：(1)类球红细菌基因组DNA的提取；(2)八氢番茄红素合成酶基因crtB的PCR扩增；(3)crtB基因过量表达载体pRKpuf‑crtB的构建；(4)利用S17‑1将表达载体pRKpuf‑crtB接合转移到类球红细菌中获得基因工程菌；(5)利用基因工程菌诱导表达类胡萝卜素并进行定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种提高类球红细菌类胡萝卜素产量的质粒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤为：(1)类球红细菌基因组DNA的提取；(2)八氢番茄红素合成酶基因crtB的PCR扩增；(3)crtB基因过量表达载体pRKpuf-crtB的构建；(4)利用S17-1将表达载体pRKpuf-crtB接合转移到类球红细菌中获得基因工程菌；(5)利用基因工程菌诱导表达类胡萝卜素并进行定量分析。2.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志平，唐艺，聂鑫，余瑶，唐阔，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：四川,51