一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法技术

本发明专利技术涉及一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术主要是在大肠杆菌中导入源于假单胞菌中的一种氧化酶基因。该重组菌能催化丙烯基苯类化合物合成胡椒醛，所生成的胡椒醛浓度可达到9.15g/L。这种重组氧化酶合成胡椒醛的方法具有生产周期短，提取简单的特点，工业生产前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法
本专利技术涉及一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，属于生物工程

技术介绍
胡椒醛又名洋茉莉醛，其化学名为3,4-亚甲基二氧苯甲醛，具有清甜的樱桃以及香草的香气。胡椒醛在食用香料、化妆品行业、医药行业、农业以及电镀工业上都有着广泛的应用。天然洋茉莉醛主要存在于甜瓜、刺槐、香胡椒、香荚兰豆等植物中，但含量极少，人们无法从植物中直接提取获得。工业上洋茉莉醛的合成主要分为两大类：一是以从植物中提取的黄樟油素、胡椒碱为原料的半合成法；二是采用完全由化学合成的邻苯二酚、对甲基苯酚原料的全合成法。其中以黄樟油素、邻苯二酚为底物的合成胡椒醛的方式为主流，而这一过程中需要大量的酸碱液以及能耗，过程复杂，对环境有着不可逆的伤害。在此期间有相关文献报道提出以胡椒环、胡椒酸等方式合成，但其收率低、实用性较差。胡椒醛的微生物合成报道极少，且并没有应用于工业生产。在巴西Santos团队，发现几株能利用异黄樟素生成胡椒醛的微生物，其中效率最高的菌株为宛氏拟青霉菌，但只有在添加H2O2条件下，最高产量为64mg/L，转化率仅为20％。国内赵明涛等筛选到一株液化沙雷氏菌，能产282mg/L胡椒醛。韩国Ryu所在团队发现恶臭假单胞菌JYR-1中存在一种自给型黄素单加氧酶，能催化苯丙素类化合物转化为相应的芳香醛或芳香酸类化合物，并将该酶命名为Trans-AnetholeOxygenase(TAO)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于是提供一种能利用重组氧化酶生物合成胡椒醛的方法。本专利技术解决的第一个技术问题于提供重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(tao)的构建方法。根据质粒pET-22b(+)以及氧化酶序列，设计引物，以假单胞菌全基因组为模板，扩增氧化酶基因，并将其连接到质粒pET-22b(+)，获得重组质粒pET-22b(+)-tao；将重组质粒转入到到E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliBL21(DE3)(tao)。本发解决的第二个技术问题在于上述重组氧化酶的高效表达。重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD600为0.5～3时，加入终浓度为0.05～1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在15～35℃条件下诱导2～10h，酶活达到35U/g以上。本专利技术解决的第三个技术问题在于提供一种全细胞合成胡椒醛的方法。取上述培养好的重组大肠杆菌菌体，于含有1～20g/L黄樟油素、pH3～11中的反应液中，在20～40℃下反应0.5～12h，获得胡椒醛。本专利技术解决的第四个技术问题在于获得纯度大于90％以上的胡椒醛晶体。用乙酸乙酯萃取上述反应液，收集有机相，加入一定量的无水硫酸钠干燥，于40℃下真空浓缩，其收集固形物，在20～30℃真空干燥箱中烘干，获得胡椒醛晶体。本专利技术利用大肠杆菌异源表达来源于假单胞菌中的tao基因，获得重组菌株E.coliBL21(DE3)(tao)。该菌能利用黄樟油素合成胡椒醛，产量可达到9g/L以上，具有发酵周期短，操作简单，提取方便，环境友好的特点，具有良好的工业应用前景。附图说明图1PCR扩增电泳图图2XbaI以及XhoI双酶切验证图图3重组质粒pET-22b(+)-tao图图4提取的胡椒醛晶体图5胡椒醛样品红外鉴定图图6胡椒醛样品核磁共振氢谱鉴定图具体实施方式以下是重组菌酶活测定以及胡椒醛测定方式酶活测定方式：在反应体系中加入适量的诱导结束的重组菌以及黄樟油素，于30℃反应1h，取一定体积反应液，加入等体积的甲醇混匀，终止反应，1000rpm离心5min，上清液采用0.22μM的有机膜过滤，通过HPLC检测胡椒醛的含量。酶活定义：每1h生成1mmol/L的胡椒醛所需要的酶的定义量为1U，比酶活为1g干细胞所含的酶活。HPLC检测条件：采用AmethstC18-H反向柱(4.6mm×250mm，5μm)，以60％乙腈，以及0.1％的甲酸为流动相，柱温箱温度为35℃，进样量为10μL，270nm处检测胡椒醛含量。重组大肠杆菌的构建、表达及其催化合成胡椒醛重组质粒pET-22b(+)-tao的构建根据TAO氧化酶的基因序列以及pET-22b(+)质粒信息设计引物，以来自于假单胞菌(Pseudomonas，该菌可商业购买得到)全基因组为模板扩增目标基因。设计的引物分别为：上游引物taoF：5’-CGCGAATTCGATGGAGGACATCATGCAAGGC-3’；(EcoRⅠ)下游引物taoD：5’-GCGGCGGCCGCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATTG-3’。(NotⅠ)PCR扩增条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min，72℃延伸7min，其中第二阶段进行30个循环。将PCR产物采用核酸胶电泳进行验证，并回收目标条带，结果如图1。PCR产物以及pET-22b(+)质粒采用快切酶EcoRⅠ、NotⅠ同时进行双酶切，并纯化回收。将酶切的PCR产物和pET-22b(+)使用T4连接酶16℃过夜连接。将连接产物于42℃热击90s导入到E.coliJm109的感受态中保存。涂布于含有100mg/L的氨苄霉素(Amp)的LB固体培养基中，37℃培养12h。挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证。将获得的菌体进行培养，提取重组质粒pET-22b(+)-tao进行双酶切验证，测序验证，双酶切验证图如图2，重组质粒图谱见图3，测定序列见SEQIDNO:1。重组菌E.coliBL21(DE3)(tao)的构建将测序正确重组质粒pET-22b(+)-tao导入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，冰下放置30min，并将其在42℃水浴中热击90s，冰中冷却2min，加入1mL的LB培养基，于37℃培养1h后，涂布于抗性平板37℃培养12h，并进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)(tao)。重组氧化酶表达优化在抗性LB平板中挑取单菌落，接入含有100mg/L的Amp的LB培养基中，37℃，110rmp过夜培养，之后按2～5％的接种量接种于新鲜LB培养基中，当OD600为0.6～3时，加入终浓度为0.05～0.6mmol/L的IPTG，于20～30℃、110rmp条件下诱导2～10h，以8000r/min，4℃离心5min获得菌体；将收集的菌体测定其比酶活，确定最适IPTG浓度为0.05～0.1mmol/L，诱导温度为20～25℃、诱导时间为6～8h，诱导时机为菌体当OD600为1.25～2，相较于未优化前，优化后比酶活提高1.7倍以上。不同反应条件对比酶活的影响收集诱导结束的重组菌，作为生物催化剂，以黄樟油素为底物进行催化反应，合成胡椒醛。分别在pH为3～11的缓冲液中，添加1mmol/L的Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Li+、Ni+、K+、Fe3+、Fe2+金属离子，于20～40℃反应20min，测定反应中胡椒醛的浓度，比较比酶活，确定最适的反应缓冲液pH为7～9，反应温度为30～35℃左右，不添加金属离子。不同底物浓度的胡椒醛合成情况按上述反应方式，在反应体系中，添加黄樟油素的浓度分别为10～20g/L，分别在0～12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，包括如下步骤：1)根据TAO氧化酶的基因序列以及pET‑22b(+)质粒信息设计引物，以来自于假单胞菌全基因组为模板扩增目标基因；设计的引物分别为：上游引物taoF：5’‑CGC

【技术特征摘要】
1.一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，包括如下步骤：1)根据TAO氧化酶的基因序列以及pET-22b(+)质粒信息设计引物，以来自于假单胞菌全基因组为模板扩增目标基因；设计的引物分别为：上游引物taoF：5’-CGCGAATTCGATGGAGGACATCATGCAAGGC-3’；(EcoRⅠ)下游引物taoD：5’-GCGGCGGCCGCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATTG-3’(NotⅠ)经PCR扩增获得TAO氧化酶基因；2)将步骤1)中的PCR扩增产物以及pET-22b(+)质粒采用快切酶EcoRⅠ、NotⅠ同时进行双酶切，并纯化回收；将酶切的PCR产物和pET-22b(+)使用T4连接酶15-20℃过夜连接，获得重组质粒pET-22b(+)-tao；3)将步骤2)中的重组质粒转入到E.coliBL21(DE3)，获得重组菌E.coliBL21(DE3)(tao)：将重组质粒加入至E.coliBL21(DE3)感受态中，冰下放置10-40min，并将其在40-45℃水浴中热击60-120s，冰中冷却1-5min，加入0.5-2mL的LB培养基，于30-40℃培养0.5-3h后涂布获得重组菌株E.coliBL21(DE3)(tao)；4)重组菌株合成胡椒醛：将步骤3)中的重组菌株E.coli...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑璞，邓志敏，邢晨光，赵希景，陈鹏程，刘思琴，
申请(专利权)人：江南大学，厦门欧米克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32