一种可提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该信号肽的核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。本发明专利技术提供了一种可提高分泌效率的信号肽，使用后可显著提高菌株的分泌能力，为枯草芽孢杆菌对外源基因的表达提供了有效的元件，可将其应用于耐热β‑半乳糖苷酶和转谷氨酰胺酶的表达。

【技术实现步骤摘要】
一种可提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种可提高蛋白分泌效率的信号肽及其应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，在工业酶生产中有着广泛的应用。与其它原核表达系统相比，以枯草芽孢杆菌作为宿主进行蛋白表达具有如下优势:1、遗传背景清晰，已完成全基因组测序；2、没有密码子偏爱性；3、发酵简单，对营养无特殊要求；4、拥有一套高效蛋白分泌系统，并且经其分泌的蛋白质多具有生物活性与天然的构象；5、无致病性，不产生任何内毒素。近年来，对于枯草芽孢杆菌表达分泌系统及相关分泌元件有了较为深入的研究，其中信号肽序列的筛选作为一种有效提高目的蛋白分泌产量的策略手段，被广泛应用于各种工业酶的生产中。信号肽是位于新生分泌蛋白质及细胞膜蛋白N端的一段特有的氨基酸序列，它对于蛋白的跨膜分泌效率有着重大的影响。信号肽序列一般不具有明显的氨基酸序列保守性，一般由带有正电荷的N结构域、富含疏水氨基酸的H结构域以及带有负电荷的C结构域组成。有研究结果表明分泌蛋白与信号肽之间存在着适配性的问题，不同信号肽引导同一蛋白分泌效率差异显著。因此，研究枯草芽孢杆菌自身不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可提高蛋白分泌效率的信号肽。本专利技术的另一目的在于提供所述可提高蛋白分泌效率的信号肽的编码基因。本专利技术的又一目的在于提供所述可提高蛋白分泌效率的信号肽的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种可提高蛋白分泌效率的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQIDNO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。含上述任一所述可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒均属于本专利技术的保护范围。所述的重组基因工程菌为将上述任一所述可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因融合到需要表达基因的N端，使融合后的基因编码的蛋白的N端融合有相应信号肽；优选为分泌β-半乳糖苷酶能力提高的基因工程菌，或为能分泌转谷氨酰胺酶的基因工程菌；更优选为枯草芽孢杆菌基因工程菌。所述的可提高蛋白分泌效率的信号肽在提高目的蛋白分泌表达中的应用。所述的目的蛋白为耐热β-半乳糖苷酶或转谷氨酰胺酶。所述的目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达；优选为在枯草芽孢杆菌中分泌表达。所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌ATCC6051(B.subtilisATCC6051)。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高β-半乳糖苷酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与转谷氨酰胺酶酶原编码基因相结合的表达载体，实现了转谷氨酰胺酶酶原的分泌表达。2、本专利技术提供了一种氨基酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。3、本专利技术通过融合信号肽，可以使β-半乳糖苷酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。本专利技术通过融合信号肽，实现转谷氨酰胺酶酶原分泌表达。附图说明图1是实施例1中扩增biobrick的PCR产物电泳图；其中，泳道M为markerDNA，泳道1为biobrick的PCR扩增产物。图2是实施例1中质粒pBEp43s-biobrick-bgaB和质粒pBEp43-SP-bgaB构建示意图。图3是实施例2中扩增SPylaE片段电泳图；其中，泳道M为markerDNA，泳道1为SPylaE片段。图4是实施例2中表达质粒pBEp43-SPylaE-proMTG的构建示意图。图5是实施例2中B.subtilisATCC6051(pBEp43-SPylaE-proMTG)表达的SDS-PAGE电泳胶图；其中，泳道M为marker，泳道1为B.subtilisATCC6051，泳道2为B.subtilisATCC6051(pBEp43-SPylaE-proMTG)，箭头表示目的蛋白MTG的位置。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)。实施例1β-半乳糖苷酶高效分泌表达的信号肽的筛选参考(ChristianDegeringet.Al,2010)的方法，通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因(bgaB)相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得不同程度提高β-半乳糖苷酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：(1)构建pBEp43-biobrick-bgaB载体：以两段人工合成片段SEQIDNO.3、SEQIDNO.4退火延伸得到的biobrick(生物积木)的PCR片段带有酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，用限制性内切酶消化并纯化的100bp大小的PCR产物(如图1)插入质粒pBE-P43-bgaB(按专利文献：潘力等.一种具有启动子功能的DNA片段与应用.CN201510074949.0[P].2015.构建)相同内切酶位置，得到pBEp43s-biobrick-bgaB质粒(如图2)，设计的biobrick的PCR片段如SEQIDNO.5所示。扩增的PCR片段碱基序列由Sanger测序确认。(2)构建pBEp43-SP(signalpeptidedatabase)-bgaB载体：提取枯草芽孢杆菌(Bacillussubttlis168，购于广东省微生物菌种保藏中心)基因组DNA(Omega细菌基因组DNA抽提试剂盒)，使用相应引物(F-SpylaE：5′-GAGAGGAATGTCGACATGAAGAAAACATTTGTAAAAAAAG-3′；R-SPylaE(5′-CGTTGTCCATCTCGAGTGCGCTGGCTGCATCAGGACCGAA-3′)对基因组DNA进行扩增，将PCR产物回收(OmegaDNA凝胶回收试剂盒)，经过克隆转化插入上述构建好的pBEp43-biobrick-bgaB载体中，使用酶切位点为KpnⅠ和XhoⅠ，构建成pBEp43-SP-bgaB载体(如图2)。(3)将构建好的pBEp43-SP-bgaB载体通过电转化到枯草芽胞杆菌B.subtilisATCC6051，具体方法参考非专利文献记录(NataliaP，Zakataeva，OksanaVetal.Asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationint本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可提高蛋白分泌效率的信号肽，其特征在于：所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可提高蛋白分泌效率的信号肽，其特征在于：所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQIDNO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。3.含有权利要求2所述的可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒。4.一种重组基因工程菌，其特征在于：将权利要求2中所述的可提高蛋白分泌效率的信号肽的基因融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，刘欣，叶燕锐，王斌，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44