一种可有效提高分泌的信号肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可有效提高分泌的信号肽及其应用。该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该信号肽的核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。本发明专利技术提供了一种具有很强的分泌表达活性的信号肽，通过融合信号肽，可以使β‑半乳糖苷酶分泌量增加，也可以实现转谷氨酰胺酶酶原分泌表达。

【技术实现步骤摘要】
一种可有效提高分泌的信号肽及其应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种可有效提高分泌的信号肽及其应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，可内生抗逆孢子，细胞壁的组成结构简单，不含内毒素，仅有单层外膜，因此当分泌蛋白通过细胞膜，并在细胞间质进行加工折叠后，便直接释放进入培养液中；且对培养条件要求不高，在规模化生产中能够保持较高的细菌浓度，因此其在工业酶的生产有着广泛应用；人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于大肠杆菌(Escherichiacoli)。基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。在枯草芽孢杆菌表达系统中，来源于革兰氏阳性菌的蛋白一般都能利用自身信号肽有效表达分泌，其表达产物对宿主菌的蛋白酶也有一定的耐受性，但是异源蛋白的分泌表达则较困难，通常都要与芽孢杆菌胞外蛋白启动子和信号序列融合才能使分泌表达有效进行。因此，研究枯草芽孢杆菌自身不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达及分泌机制等均有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可有效提高分泌的信号肽。本专利技术的另一目的在于提供所述可有效提高分泌的信号肽的编码基因。本专利技术的又一目的在于提供所述可有效提高分泌的信号肽的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种可有效提高分泌的信号肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码所述可有效提高分泌的信号肽的基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQIDNO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。含上述任一所述可有效提高分泌的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒也属于本专利技术的保护范围。所述的重组基因工程菌为将上述任一所述可有效提高分泌的信号肽的基因融合到需要表达基因的N端，使融合后的基因编码的蛋白的N端融合有相应信号肽；优选为分泌β-半乳糖苷酶能力提高的基因工程菌；或为能分泌转谷氨酰胺酶的基因工程菌；更优选为枯草芽孢杆菌基因工程菌。所述的可有效提高分泌的信号肽在提高目的蛋白分泌表达中的应用。所述的目的蛋白为耐热β-半乳糖苷酶或转谷氨酰胺酶。所述的目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达；优选为在枯草芽孢杆菌中分泌表达。所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌ATCC6051(B.subtilisATCC6051)。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高β-半乳糖苷酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与转谷氨酰胺酶酶原编码基因相结合的表达载体，实现了转谷氨酰胺酶酶原的分泌表达。2、本专利技术提供了一种氨基酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。3、本专利技术通过融合信号肽，可以使β-半乳糖苷酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。4、本专利技术通过融合信号肽，实现转谷氨酰胺酶酶原分泌表达。附图说明图1是实施例1中扩增biobrick的PCR产物电泳图；其中，泳道M为markerDNA，泳道1为biobrick的PCR扩增产物。图2是实施例1中质粒pBEp43s-biobrick-bgaB和质粒pBEp43-SP-bgaB构建示意图。图3是实施例2中扩增SPcccA片段电泳图；其中，泳道M：markerDNA；泳道1为SPcccA片段。图4是实施例2中表达质粒pBEp43-SPcccA–proMTG的构建示意图。图5是实施例2中B.subtilisATCC6051(pBEp43-SPcccA-proMTG)表达的SDS-PAGE电泳胶图；其中，泳道M：marker；泳道1为B.subtilisATCC6051；泳道2为B.subtilisATCC6051(pBEp43-SPcccA-proMTG)；箭头表示目的蛋白MTG的位置。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)。实施例1β-半乳糖苷酶高效分泌表达的信号肽的筛选参考(ChristianDegeringet.Al,2010)的方法，通过从枯草芽孢杆菌同源蛋白信号肽库中，构建各种信号肽与β-半乳糖苷酶编码基因(bgaB)相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得不同程度提高β-半乳糖苷酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：(1)构建pBEp43-biobrick-bgaB载体：以两段人工合成片段SEQIDNO.3、SEQIDNO.4退火延伸得到的biobrick(生物积木)的PCR片段带有酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，用限制性内切酶消化并纯化的100bp大小的PCR产物(如图1)插入质粒pBE-P43-bgaB(按专利文献：潘力等.一种具有启动子功能的DNA片段与应用.CN201510074949.0[P].2015.构建)相同内切酶位置，得到pBEp43s-biobrick-bgaB质粒(如图2)，设计的biobrick的PCR片段如SEQIDNO.5所示。扩增的PCR片段碱基序列由Sanger测序确认。(2)构建pBEp43-SP(signalpeptidedatabase)-bgaB载体：提取枯草芽孢杆菌(Bacillussubttlis168，购于广东省微生物菌种保藏中心)基因组DNA(Omega细菌基因组DNA抽提试剂盒)，使用相应引物(F-SpcccA：5′-GAGAGGAATGTCGACATGAAATGGAACCCGCTTATTCCAT-3′；R-SpcccA：5′-CGTTGTCCATCTCGAGTCCTTTTACTGATAAAAAGAAAGT-3′对基因组DNA进行扩增，然后将PCR产物回收(OmegaDNA凝胶回收试剂盒)，经过克隆转化插入上述构建好的pBEp43-biobrick-bgaB载体中，使用酶切位点为KpnⅠ和XhoⅠ，构建成pBEp43-SP-bgaB载体(如图2)。(3)将构建好的pBEp43-SP-bgaB载体通过电转到化枯草芽胞杆菌B.subtilisATCC6051，具体方法参考非专利文献记录(NataliaP，Zakataeva，OksanaVetal.Asimplemethodtointroducemarker-freegeneticmodificationintochromosomeofnaturallynontransformableBacillusamyloliquefaciensstrains[J].ApplMicrobiolBiotechnol.2010,85:1201-1209)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可有效提高分泌的信号肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可有效提高分泌的信号肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的可有效提高分泌的信号肽的基因，其核苷酸序列选自如下任一序列：(a)如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对SEQIDNO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或者其互补序列。3.含有权利要求2所述的可有效提高分泌的信号肽的基因的重组表达载体、重组基因工程菌、转基因细胞系或表达盒。4.一种重组基因工程菌，其特征在于：将权利要求2中所述的可有...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，刘欣，叶燕锐，王斌，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44