一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：通过铸模法或3D打印方式得到具有分枝状结构的牺牲模；在牺牲膜的表面涂覆或喷涂含致孔剂的聚合物溶液得到聚合物薄膜；去除经上述处理的结构的牺牲膜和致孔剂得到具有表面孔隙的类血管通道结构；在类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞；在类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞；将经上述处理的类血管通道结构置于模具中，加入含实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。本发明专利技术方法可在人工组织内构建具有多层结构的仿生血管。

A bionic vascularized soft tissue with multi-layer vascular structure and its preparation method

The invention discloses a bionic vascularized soft tissue with multi-layer vascular structure and a preparation method. The preparation method comprises the following steps: get the sacrifice mold having a branched structure by casting method or 3D printing; obtain polymer film in polymer solution on the surface of the sacrificial film coated or sprayed with porogen; removal of vascular channel structure with surface pore structure of the sacrificial film obtained by processing and induced pore channel structure; in vascular endothelial cells grown in channel perfusion; on the surface of pore channel structure in plant vascular smooth muscle cells or fibroblasts; the structure of the vascular channel in the mold processing, solution containing hydrogel parenchymal cells, casting to obtain bionic vascularized soft tissue. The method of the invention can construct a bionic blood vessel with multilayer structure in artificial tissue.

【技术实现步骤摘要】
一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法
本专利技术涉及一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法，属于组织工程和生物制造

技术介绍
组织工程(TissueEngineering)是一门前沿交叉科学，其基本原理为通过在体外构建具有一定结构与功能的仿生人工组织，修复、替代病损的组织。虽然组织工程已经在皮肤、骨/软骨、膀胱、血管等领域得到部分应用，但在复杂大块组织的构建上仍然面临巨大的挑战，其中血管化是组织工程的最大挑战之一。对于代谢旺盛的组织如心肌、肝脏，由于细胞具有很高的物质及能量代谢水平，这些组织内部有着复杂而丰富的血管网络。在组织工程支架内，氧和营养物质的传输距离在100μm左右，光靠扩散无法满足支架内部的代谢需求；同时体内移植，宿主血管长入支架至少需要三至五天。因此在支架内体外预血管化，显得十分迫切。目前血管化是组织工程的研究热点之一。在体外构建血管化组织，必须借鉴天然血管的结构与形成机制。天然血管形成是个涉及多种细胞、生长因子、细胞外基质、氧等相互作用的动态、复杂的过程。天然血管形成主要有两种机制，血管发生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，在胚胎发育过程中，先各处形成“血岛”(主要为血管发生)，在出芽、生长、连接、分化(主要为血管新生)，形成复杂分级的血管网络。天然血管分为动、静脉、毛细血管，他们的结构组成与功能各不相同。其中，动静脉可以大、中、小、微动静脉，结构类似，分为内膜、中膜、外膜，分别由内皮层(内皮细胞)，弹性层、平滑层(平滑肌细胞)，结缔组织组成；毛细血管是氧和营养物质主要的交换场所，主要为由单层内皮细胞形成的管腔结构，分为连续、有孔毛细血管以及血窦。目前常见的体外预血管化策略包括：内皮细胞共培养，构建微流体通道，复合促血管生长因子，灌注培养，体内预血管化，微单元体组装如微水凝胶、细胞微球，血管床等方法。最新的研究包括2016年Nature报道的MilicaRadisic课题组构建含微流体通道的水凝胶，通过软光刻与层层堆积的方式成形类血管通道结构，在通道内灌注内皮细胞形成内皮层，在通道外铸模含实质细胞(心肌细胞、肝细胞)的水凝胶，形成血管化的工程组织；以及2016年PNAS报道的JenniferA.Lewis课题组三维打印血管化大块组织，通过多喷头细胞打印机，同时打印支撑材料(树脂)、多种细胞(干细胞和实质细胞)、牺牲材料(PluronicF-127)，通过降温流出PluronicF-127形成类血管通道结构，再灌注种植内皮细胞，培养形成血管化大块组织。这些体外构建的组织血管化程度，多为内皮细胞的自组装，形成初步、简单的内皮细胞管腔结构，离真正成熟、可灌注的分级血管网络，还相差甚远。目前有一些研究通过从通道周围的实质区域，向通道的内皮层吸引、招募平滑肌细胞、成纤维细胞的方式来构建成熟的血管结构，这种方法效率很低而且需要复杂的生物因子调控。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在水凝胶内构建具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，具体是，通过构建具有一定壁厚和表面孔隙的通道网络结构，在通道内部灌注种植内皮细胞，在通道表面的孔隙壁内种植平滑肌、成纤维细胞等细胞，然后在通道外铸模含实质细胞的水凝胶。通过本专利技术方法，可以在人工组织内构建具有多层结构的仿生血管：内皮细胞层+平滑肌层。本专利技术方法有望构建成熟、可灌注的复杂血管结构，进一步发育形成大块血管化组织，在组织器官修复、药物筛选、病理模型研究等有重要应用。本专利技术所提供的具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，包括如下步骤：(1)通过铸模法或3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；(2)在所述牺牲膜的表面涂覆或喷涂含有致孔剂的聚合物溶液，得到聚合物薄膜；(3)去除经步骤(2)处理的结构的所述牺牲膜和所述致孔剂，得到具有表面孔隙的类血管通道结构；(4)在所述类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞，以模拟血管结构的内皮层；在所述类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞等细胞，以模拟血管结构的中膜层；(5)将经步骤(4)处理的所述类血管通道结构置于模具中，加入含有实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。上述的制备方法中，所述3D打印方式可采用连续挤出工艺、立体光刻工艺和激光微熔覆烧结等工艺中的一种；所述铸模法具体为：通过制备含所述通道网络结构的PDMS模具，在其中浇铸液态牺牲模材料，通过冷却或者光聚合固化，成形多分支形态的可溶性牺牲模。制备所述牺牲模的材料为具有较好的可溶性、生物相容性及力学性能的材料，具体可为糖类化合物、聚乙烯醇(PVA,polyvinylalcohol)、明胶、琼脂糖、碱溶性光敏聚合物等中的至少一种；所述糖类化合物可为葡萄糖、麦芽糖和蔗糖中至少一种；所述明胶的分子量可为15000～250000Da，可以是A型明胶，也可以是B型明胶；所述聚乙烯醇的分子量可为2.5～30万，醇解度为78％～98％；所述碱溶性光敏聚合物可为二甲基-丙烯酰胺、甲基丙烯酸和聚乙烯基吡咯烷酮的共聚物，三者的质量比为11：11：3。上述的制备方法中，当制备所述牺牲模的材料为糖类化合物和/或聚乙烯醇(PVA)时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：浸泡于去离子水、蒸馏水或PBS缓冲液中；当制备所述牺牲模的材料为所述碱溶性光敏聚合物时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：浸泡于NaOH水溶液中；当制备所述牺牲模的材料为所述明胶和/或琼脂糖时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：利用其“凝胶-溶胶”转变的温敏特性，置于凝胶温度点溶出。上述的制备方法中，所述分枝状结构可为1～4级分支结构。上述的制备方法中，所述聚合物溶液采用的聚合物可为聚己内酯(PCL,Polycaprolactone)、聚乳酸(PLA,Polylacticacid)、聚乙醇酸(PGA,Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,Poly(Lactide-co-Glycolide))、聚癸二酸丙三醇酯(PGS,Poly(glycerolsebacate))和聚丙交脂-乙交脂共聚物(PLLG,poly(L-lactide-co-glycolide))中至少一种；所述聚合物溶液采用的溶剂可为六氟异丙醇(HFIP)、1,4二氧六环(1,4-dioxane)、三氯甲烷等有机溶剂；所述致孔剂可为呈颗粒状的氯化钠，直径可为20μm～250μm；所述聚合物溶液中，所述聚合物的质量-体积浓度为1.0～200mg/mL，具体可为20～50mg/mL、20mg/mL、25mg/mL或50mg/mL，所述致孔剂的质量-体积浓度为1.0～200mg/mL，具体可为47～200mg/mL、47mg/mL、100mg/mL或200mg/mL。上述的制备方法中，所述聚合物薄膜的厚度可为50μm～1000μm，具体可为100μm～300μm、100μm、200μm或300μm；涂覆或喷涂结束后，经干燥即得到所述聚合物薄膜。上述的制备方法中，所述类血管通道结构的截面为圆形或者方形；所述类血管通道结构的壁厚为50μm～1000μm，具体可为100μm～300μm、100μm、200μm或30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，包括如下步骤：(1)通过铸模法或3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；(2)在所述牺牲膜的表面涂覆或喷涂含有致孔剂的聚合物溶液，得到聚合物薄膜；(3)去除经步骤(2)处理的结构的所述牺牲膜和所述致孔剂，得到具有表面孔隙的类血管通道结构；(4)在所述类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞；在所述类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞；(5)将经步骤(4)处理的所述类血管通道结构置于模具中，加入含有实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。

【技术特征摘要】
1.一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，包括如下步骤：(1)通过铸模法或3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；(2)在所述牺牲膜的表面涂覆或喷涂含有致孔剂的聚合物溶液，得到聚合物薄膜；(3)去除经步骤(2)处理的结构的所述牺牲膜和所述致孔剂，得到具有表面孔隙的类血管通道结构；(4)在所述类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞；在所述类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞；(5)将经步骤(4)处理的所述类血管通道结构置于模具中，加入含有实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：制备所述牺牲模的材料为糖类化合物、聚乙烯醇、明胶、琼脂糖和碱溶性光敏聚合物中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述分枝状结构为1～4级分支结构。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚合物溶液采用的聚合物为聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯和聚丙交脂-乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婷，方永聪，孙伟，贾波，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11