一种包含细胞靶向抗体及Poly(I：C)的化合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2‑S‑Ab，所述化合物以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷‑1‑羧酸‑3‑磺基琥珀酰亚胺酯连接四种不同的细胞靶向抗体(如靶向肝窦内皮细胞的CD146抗体、靶向枯否细胞的F4/80抗体、靶向表达IgG1抗体Fc受体细胞的IgG1同型对照抗体、靶向表达IgG2抗体Fc受体细胞的IgG2同型对照抗体)。进一步的，本发明专利技术还提供了上述化合物的制备方法以及医药用途。本发明专利技术可有效实现poly(I:C)靶向到达肝内细胞，从而使poly(I:C)与TLR3结合，通过激活不同免疫细胞TLR3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生，起到抗HBV病毒的作用。

A compound containing cell targeting antibody and Poly (I:C) and its preparation and Application

The invention provides a containing cell targeting antibody and Poly (I:C) compound CaP/PEI/poly (I:C) /SiO2 S Ab, the compound with calcium phosphate nanoparticles as the core, the surface grafting kernel PEI, kernel surface absorption of Poly (I:C), two oxygen silicon core outer shell. The silica shell by cyclohexane 1 carboxylic acid 3 sulfo succinimidyl ester connecting four different antibodies to target cells (such as targeting CD146 antibody, liver sinusoidal endothelial cells and Kupffer F4/80 antibodies targeting the target cells to express IgG1 receptor antibody Fc cell IgG1 isotype control antibody, targeting the expression of IgG2 receptor antibody Fc cell IgG2 isotype control antibody). Further, the invention also provides a preparation method of the compound and the use of the medicine. The invention can effectively achieve the poly (I:C) target reaching the liver cells, so that poly (I:C) is combined with TLR3, and enhances the production of interferon and proinflammatory factors by activating TLR3 mediated signaling pathways of different immune cells, and plays an anti HBV role.

【技术实现步骤摘要】
一种包含细胞靶向抗体及Poly(I：C)的化合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及医药
，具体涉及一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab及其制备方法和应用。
技术介绍
在多种纳米颗粒中，磷酸钙纳米颗粒具有高生物相容性、高生物降解性、体积小以及高亲和力，可与一些核酸共价功能化等特性，因其有可观的应用前景。该纳米颗粒已被用于各种领域,如转染、基因沉默、药物传输、光动力治疗等。一些大分子物质常常无法穿透细胞膜,因此,一个有效的载体如纳米颗粒是必需的。磷酸钙纳米颗粒的大小约100纳米很容易被细胞摄取，随后溶解在溶酶体中。多项研究证实多壳包裹的磷酸钙纳米颗粒可在免疫学中用途广泛,例如用于预防性和治疗性免疫和特定的B细胞活化。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中约2亿4千万人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。慢性乙型肝炎是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。目前，慢性乙肝尚缺乏有效的治疗手段，干扰素治疗仅能抑制20-40％慢性乙肝患者病毒复制，核苷类似物的药效也因病毒的耐受性突变而大大降低。近来，越来越多的研究表明，天然免疫识别受体Toll样受体(TLR)的激动剂作为免疫调节剂或免疫佐剂，有望成为治疗病毒感染、炎症性疾病和肿瘤的新型药物。天然免疫针对的主要靶分子称为病原相关分子模式(PAMP)，相对应的识别受体称为模式识别受体(PRR)。PAMP主要指病原体细胞表面的分子或核酸成分，它们在进化中趋于保守，是病原体生存所必须得。来源于病原体的核酸，包括单链和双链RNA，是PAMP的其中一大类。TLR是PRR中的一大家族，TLR3位于细胞内，能够识别病毒的双链RNA。人工合成的双链RNA类似物聚肌胞胞苷酸(poly(I:C))，为TLR3的配体，能够被TLR3识别并激活TLR3，另外poly(I:C)还能被黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)所识别。TLR3在胞内识别poly(I:C)并被其激活后，能够募集下游的衔接蛋白MyD88和TRIF，TLR3可通过MyD88依赖途径诱导炎症性细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-12的表达，参与非特异性抗病毒反应，同时通过MyD88非依赖途径诱导共刺激分子CD80和CD86以及IFN-β、IP-10等抗病毒性细胞因子的表达，参与诱导DC的分化成熟以及抗病毒免疫反应。胞质的MDA-5可在线粒体外模被线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)所招募。MDA-5虽然与TLR3利用的是不同的衔接蛋白，但下游的信号通路是相同的，都能激活一系列的转录因子，包括IRF3,IRF7和NF-κB，诱导抗炎或促炎因子(IL-6,IL-10),I型干扰素(IFN-α/β)以及共刺激分子的表达。相关的实验证实了poly(I:C)在体外刺激肝实质细胞(肝细胞)及肝非实质细胞(kupffer细胞和肝窦内皮细胞)能产生IFN-β并抑制HBV的复制。另外，用poly(I:C)高压水注射治疗HBV感染的小鼠，结果表明通过poly(I:C)治疗能够清除HBV病毒，其清除HBV的作用有依于干扰素的产生，且poly(I:C)的抗病毒作用必须通过高压水注射的方式激活肝内的TLR3。在小鼠模型中可以通过高压水注射的方式激活肝内的TLR3，但这一方法不能用于人类，目前暂时无法有效的将poly(I:C)导入到患者的肝内。因此急需一种有效载体，使得poly(I:C)能够通过静脉注射的方式靶向激活肝内的TLR3。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种以纳米颗粒为载体的包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的新型化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab及其制备方法和医药用途。本专利技术第一方面提供了一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab的制备方法，其特征在于，步骤包括：S1、制备CaP/PEI：制备PEI-磷酸钙纳米颗粒；S2、制备CaP/PEI/poly(I:C)：将步骤S1制备得到的PEI-磷酸钙纳米颗粒与水溶的poly(I:C)或含荧光素的poly(I:C)混合，15～35℃下搅拌，得到负载有poly(I:C)的PEI-磷酸钙纳米颗粒；S3、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2：将步骤S2所得CaP/PEI/poly(I:C)、四乙氧基硅烷、氨水、溶剂充分混合，15～35℃下搅拌混合液14～18小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒，再将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒溶解于超纯水中；S4、将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒共价功能化，使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表面共价结合硫醇基团或氨基基团；S5、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab：将共价功能化后的CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒加入至活化后的抗体中，所述抗体包括CD146、F4/80、IgG1、IgG2中的一种，3～5℃下反应20～28小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab纳米颗粒，将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab纳米颗粒溶解于超纯水中。本专利技术的研究中发现，人工合成的双链RNA类似物聚肌胞胞苷酸(poly(I:C))可以与TLR3结合，通过激活TLR3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生，纳米颗粒因带有细胞靶向抗体可以作为有效的载体使poly(I:C)靶向到达肝内细胞。纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。因此，本专利技术中我们将纳米颗粒作为载体与poly(I:C)结合起来，并在此基础上进一步结合了相应的抗体CD146、F4/80、IgG1或IgG2中的一种。CD146为肝窦内皮细胞(LSEC)的表面分子，F4/80为Kuppfer细胞(KC)的表面分子，这两种细胞在肝脏非实质细胞中占绝大多数，它们作为肝内的抗原提呈细胞在抗病毒免疫反应中起到了重要的作用。IgG1和IgG2分别为CD146和F4/80的同型对照抗体。我们利用了这两种细胞的抗体使该种纳米颗粒靶向性地到达特定细胞中，使得其携带的poly(I:C)在肝内发挥抗病毒的效应。并发现带有同型对照IgG2抗体的纳米颗粒有最强的抗病毒效应。因此，上述化合物有望开发成为一种预防或者治疗可对体内TLR3信号通路激活起反应的疾病的药物或保健品，本专利技术也提供了上述化合物的医药用途。优选的，步骤S1所述制备PEI-磷酸钙纳米颗粒的步骤包括：以体积比5:5:7的比例，向超纯水中注入水溶的乳酸钙、(NH4)2HPO4和PEI，搅拌。所述水溶的PEI浓度为2g/L，水溶的乳酸钙(18mmol/L,pH＝10)、(NH4)2HPO4(10.8mmol/L,pH＝10)；所述超纯水的用量为水溶的乳酸钙体积的四倍。优选的，步骤S4所述使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2‑S‑Ab，其特征在于：所述化合物以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷‑1‑羧酸‑3‑磺基琥珀酰亚胺酯连接细胞靶向抗体，所述细胞靶向抗体包括靶向肝窦内皮细胞的CD146抗体、靶向枯否细胞的F4/80抗体、靶向表达IgG1抗体Fc受体细胞的IgG1同型对照抗体、靶向表达IgG2抗体Fc受体细胞的IgG2同型对照抗体中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab，其特征在于：所述化合物以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯连接细胞靶向抗体，所述细胞靶向抗体包括靶向肝窦内皮细胞的CD146抗体、靶向枯否细胞的F4/80抗体、靶向表达IgG1抗体Fc受体细胞的IgG1同型对照抗体、靶向表达IgG2抗体Fc受体细胞的IgG2同型对照抗体中的一种。2.一种包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab的制备方法，步骤包括：S1、制备CaP/PEI：制备PEI-磷酸钙纳米颗粒；S2、制备CaP/PEI/poly(I:C)：将步骤S1制备得到的PEI-磷酸钙纳米颗粒与水溶的poly(I:C)或含荧光素的poly(I:C)混合，15～35℃下搅拌，得到负载有poly(I:C)的PEI-磷酸钙纳米颗粒；S3、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2：将步骤S2所得CaP/PEI/poly(I:C)、四乙氧基硅烷、氨水、溶剂充分混合，15～35℃下搅拌混合液14～18小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒，再将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒溶解于超纯水中；S4、将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒共价功能化，使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表面共价结合硫醇基团或氨基基团；S5、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab：将共价功能化后的CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒加入至活化后的抗体中，所述抗体为CD146、F4/80、IgG1、IgG2中的一种，3～5℃下反应20～28小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab纳米颗粒，将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab纳米颗粒溶解于超纯水中。3.如权利要求2所述的包含细胞靶向抗体及Poly(I:C)的化合物CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-S-Ab的制备方法，其特征在于：步骤S1所述制备P...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珺，邹诗，黄顺梅，杜艳芹，马赛厄斯·埃普尔，维多利亚·索科洛娃，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42