重组卵以及基于鸟类腺病毒的基因克隆和表达载体制造技术

我们描述了一种新的技术，该技术用于产生含有重组蛋白质的卵，该技术基于鸟类腺病毒（ＡＡＶ）的全新应用。经腺病毒感染的具胚卵被用作为宿主生物体。从每个卵中分离出大量的所合成的蛋白质并且其纯化省去了纯化的耗时步骤。根据所知，在鸟类中的翻译和翻译后修饰机制与诸如人类、兽类动物和植物这样的其它高等真核生物同一。与用于产生重组蛋白质的细菌、酵母和植物宿主系统相比，鸟类胚实现了对不含内毒素的生物活性形式的蛋白质分离。高产量和获得天然蛋白的高几率使该系统成为生物技术的一个独特的选择，该系统比近来用于该目的的其它宿主更为优越。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域。本专利技术特别涉及到含有重组蛋白和/或重组DNA的卵以及用于在卵中进行重组蛋白生产的载体和基因。
技术介绍
将遗传信息转入可进入市场的产品是制药产业中的一种新兴范例。生物产品市场预期到2000年可达到1500亿美元，这在很大程度上由基因组学和新药的发现所推动。这一增长反映了对新发现的基因进行分子鉴定的需求，这些基因地功能可能为疾病提供治疗。一旦这些基因被鉴别，通常会需要更大量的生产以进行研究和临床试验，这些研究和试验可导致可进入市场的产品。能够用于生产临床质量的产品的重组蛋白生产技术很少。将细菌、酵母或昆虫细胞培养系统作为生产制造过程的基础仍然是困难、不可预期和昂贵的。因此，需要开发一种高产的重组蛋白表达系统，该系统便于使用，而且扩大至制造生产水平所需的成本较低。专利技术概述为满足这些需求，本专利技术针对一种鸡腺病毒表达载体(AdCEV)，该载体为一种基于1型禽类腺病毒(Ad FAV1)的重组蛋白表达载体。该Ad FAV1的宿主为受精的鸡卵，该宿主多年以来为多种用于对人类或者动物进行免疫接种的病毒的生长提供了简单的途径。例如，多种家禽疫苗以及用于人类或者动物的流感疫苗仍然在受精的卵中生产制造。本专利技术将可在受精卵中生产的可用的高价值产物的范围，扩展至可通过本专利技术的AdCEV系统稳定表达的任何蛋白。AdCEV转染将每个卵变成一个在卵液中生产大量重组蛋白的袖珍工厂。我们的方法消除了对筛选步骤的需要，在转染之后产生了高百分比的重组细胞。本专利技术的AdCEV/卵系统提供了以下的优点1.简便和低成本；2.高产量-毫克级的蛋白/卵；3.简短的生产步骤-孵育72小时；4.真核蛋白的正确加工；5.从卵液中的简单纯化程序；6.用于大批量生产的简单规模化；和7.高水平的生物安全性。本专利技术进一步针对一种含有重组蛋白的卵。该卵可为一种家禽卵。该卵可以是易感于腺病毒感染的任何鸟类的卵。本专利技术进一步针对一种含有重组DNA的卵。本专利技术进一步针对一种含有重组RNA的卵。本专利技术还针对于一种制备含有异源基因的重组鸟类腺病毒载体的方法，该方法包括这些步骤(a)制备一种含有鸟类腺病毒DNA的质粒、粘粒或者噬菌体，所述的DNA含有(i)至少一种转录调控序列，该序列邻接于至少一种限制性内切核酸酶位点，以及(ii)来自Ad FAV1基因组的非必需区域的DNA，该DNA侧生于所述的转录调控序列和所述的限制性内切核酸酶位点；以及(b)向邻接于所述的转录调控序列的所述的限制性切核酸酶位点，插入至少一个来自外源基因的蛋白质编码序列。本专利技术进一步针对遗传修饰鸟类腺病毒的方法，包括以下步骤(a)制备一种载体，该载体含有包含鸟类腺病毒DNA的质粒、粘粒或者噬菌体，所述DNA含有(i)至少一种转录调控序列，该序列邻接于至少一个限制性内切切核酸酶位点，以及(ii)来自鸟类腺病毒的非关键区域的DNA，该DNA侧生于所述的转录调控序列和所述的限制性内切核酸酶位点；以及(b)向邻连于所述的转录和翻译调控序列的所述的限制性内切核酸酶位点插入至少一个来自外源基因的蛋白质编码序列；(c)提供至少一种经重组鸟类腺病毒感染的细胞；(d)从所述的细胞中分离出一种能够表达所述的蛋白质编码序列的重组鸟类腺病毒。本专利技术进一步针对于一种方法，该方法使用一种重组鸟类腺病毒作为一种疫苗，该方法包括步骤(a)制备一种感染性鸟类腺病毒，该病毒中含有一种嵌合基因，该基因含有至少一种鸟类腺病毒转录和翻译调控序列以及至少一种来自外源基因的蛋白质编码序列，所述的嵌合基因侧生于来自鸟类腺病毒基因组的非必需区域的DNA，这样使所述的腺病毒能够感染一种细胞时，表达所述的蛋白质编码序列。在第二个步骤中，以一种接种体对一种动物或者人类进行接种，该接种体含有的所述的重组蛋白的浓度足以在该动物或者人类体内引发免疫反应。本专利技术进一步针对于一种载体，该载体含有(a)一种质粒、粘粒或者噬菌体；(b)一种嵌合基因，该基因含有来自一种外源基因的至少一种鸟类腺病毒转录和翻译调控序列；以及(c)来自鸟类腺病毒基因组的非必需区域的DNA，所述的DNA侧生于所述的嵌合基因。本专利技术进一步针对于一种感染性鸟类腺病毒，该病毒中含有一种嵌合基因，该基因含有至少一种鸟类腺病毒转录和翻译调控序列以及至少一种来自外源基因的蛋白质编码序列，所述的嵌合基因侧生有来自鸟类腺病毒基因组的非必需区域的DNA，这样使所述的腺病毒能够在感染细胞时，表达所述的蛋白质编码序列。在一个替代的实施方案中，本专利技术针对于一种感染性鸟类腺病毒重组子，该重组子通过含有以下步骤的过程产生(a)制备一种载体，该载体含有一种含有鸟类腺病毒DNA的细菌或者酵母质粒、粘粒或者噬菌体，所述的DNA含有(i)至少一种转录和翻译调控序列，该序列邻接于至少一个限制性内切核酸酶位点，以及(ii)来自鸟类腺病毒基因组的非必需区域的DNA，该DNA侧生于所述的转录调控序列和所述的限制性内切核酸酶位点；(b)向邻接于所述的转录和翻译调控序列的所述的限制性内切核酸酶位点，插入至少一个来自外源基因的蛋白质编码序列。在一个替代的实施方案中，本专利技术针对于在卵液中生产大量的来自一种被表达基因的重组蛋白。在某些情况下，目的基因编码一种表达得很少的蛋白，即，该蛋白产量不丰并且/或者在天然生理条件下仅进行瞬时生产。在其它情况下，该待表达的基因的大小超过了病毒的“非必需区域”的容量，该“非必需区域”可在不影响该重组病毒的所需感染力的情况下被替换。一种增强蛋白质生产的途径是使用瞬时细胞表达系统，在该系统中细胞经“微型染色体”转染，该“微型染色体”预期不能整合入宿主细胞基因组。在瞬时细胞表达系统中使用的微型染色体也可经修饰而进一步提高其在被感染细胞的复制期间的拷贝数。本专利技术包括两个被克隆的反向腺病毒末端序列在一种载体DNA分子中的整合，以及以该载体同作为辅助病毒的非缺陷腺病毒DNA一起进行的对细胞的共转染。在这些系统中，辅助腺病毒DNA以反式途径提供了载体包装所需的所有蛋白质功能，该载体仅仅含有病毒DNA复制和包装所需的顺式作用元件，主要是反向末端重复序列(包括病毒复制起点)以及包装信号序列。在本专利技术中，该载体系统由一种DNA微型染色体和作为辅助病毒的非缺陷型腺病毒DNA组成，该染色体含有一种可被反式激活的转录序列(启动子)、一个增强转录的RNA稳定序列、至少一种来自外源基因的蛋白质编码序列以及载体复制所需的反向腺病毒末端。在一个替代的实施方案中，该载体系统由一个DNA微型染色体和作为辅助病毒的非缺陷型腺病毒粒子组成，该染色体含有一种可被反式激活的转录序列(启动子)、一个增强翻译的RNA稳定序列、至少一种来自外源基因的蛋白质编码序列以及载体复制所需的反向腺病毒末端。由此，鉴于上述公开的内容，熟练的遗传工程人员可构建一些转染子，这些转染子克服了与表达载体的大小限制以及特定的低水平表达基因相关的生产问题。在具体情况下，这些重组DNA技术的技术人员可设计编码一种目的蛋白的适当的DNA载体、来自基因组左右两端的DNA复制的腺病毒起点、转录反式激活子和翻译激活物，以及作为辅助病毒的腺病毒DNA，并且随后使用本文披露的转染子制造方法来通过转基因卵的生产而获得大量的目的蛋白。这样的蛋白可以以天然形式或者截短类似本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个含有一种重组蛋白质的卵。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：VI格拉布科，ER布莱登，
申请(专利权)人：坎默根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]