用于将外源基因导入气道上皮细胞的重组仙台病毒载体制造技术

本发明专利技术提供用于将外源基因导入气道上皮的重组仙台病毒，以及利用该载体导入外源基因的方法。所述重组仙台病毒载体能通过与天然的被粘液覆盖的气道上皮细胞短暂接触而将基因有效转移至这些细胞中。此外，所述载体不仅能将基因导入最表层，还可导入至大量表达ＣＦＴＲ的粘膜下腺体中。所述载体因此可用于ＣＦ（ＣＦＴＲ－缺陷型疾病）的基因治疗。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供用于将外源基因导入气道上皮的重组仙台病毒，以及利用该载体导入外源基因的方法。背景领域随着分子克隆技术的出现，鉴定并分离出一系列带有导致重要人类疾病的突变基因。人类患者中缺失或突变基因可通过回体(ex vivo)技术来置换，这种技术包括用裸露的DNA、包裹在脂质体中的DNA、适当的整合载体体外转化细胞，然后导入宿主器官(回体基因治疗)。基因治疗提供了将所需基因转移至受试者并随后使其在体内表达的手段(means)。基因转移可通过回体转染受试者的细胞或组织，再将经转化的材料导入该宿主中来完成。或者，可将基因直接给与受体。Nabel等，Science(1990)2491285-1288涉及用含有β-gal表达质粒的脂质体体内动脉内转染猪。在动脉壁上观察到位点特异性基因表达。回体治疗存在若干缺点。例如，如果仅有分化的正在复制的细胞被感染，新导入的基因功能可能随这些细胞的成熟和死亡而丢失。回体方法仅可用于转染有限量的细胞，不能用于转染那些并非首次从机体内取出的细胞。如上所述，在基因治疗中，适当选择所要导入的基因、表达导入基因的靶细胞、适应于靶组织的基因转移方法、以及给与的途径是非常重要的。囊性纤维变性(Cystic fibrosis，CF)是一种常染色体隐性遗传病，它导致代谢的先天性障碍。CF患者在美国和欧洲较常见。每2,000-2,500个婴幼儿中就有一个罹患此病。该疾病的主要症状是异常外部分泌产生粘性分泌物，这些粘性分泌物在诸如肺部、呼吸道、胰腺、肝脏和小肠等器官中积累。目前对CF的治疗主要集中在肺移植和对肺传染病(严重致死性)的抗生素治疗。已经鉴定出囊性纤维变性跨膜传导调节子(CFTR)基因作为CF的致病基因(Riordan，J.R.等，Science 2451066-1073，1989)，预计可开发对CF的基因治疗，其中将携有正常CFTR基因的载体导入气道上皮。在CF的基因治疗中，外源基因需体内导入，因为回体治疗不能应用于肺部和上呼吸道。已进行多项尝试来将载体给与肺。Hazinski等(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(1991)4206-209)公开了DNA经脂质体介导而转移至完整的啮齿动物肺部。将阳离子脂质体与以下三种融合基因构建体复合1)与劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子相连的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因；2)与小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子相连的CAT基因；和3)巨细胞病毒-β-半乳糖苷酶(CMV-β-gal)融合基因。将脂质体/DNA复合体逐步灌入大鼠气管颈部，可检测到基因表达。Brigham等(Am.J.Med.Sci.(1989)298278-281)描述了CAT基因以脂质体为载体向鼠肺的体内转染。转染通过静脉内、气管内、或腹膜内注射而实现。静脉内给药和气管内给药都导致CAT基因在肺内的表达。但腹膜内给药不行。Canonico等(Clin.Res.(1991)39219A)描述了受CMV启动子驱动的人类α-1抗胰蛋白酶基因在培养的牛肺上皮细胞中的表达。所述基因利用阳离子脂质体添加至培养的细胞中。试验中还检测了新西蓝白兔(New Zealandwhite rabbit)静脉运送了与脂质体复合的基因构建体后，α-1抗胰蛋白酶在其肺组织切片中的表达。此外，美国专利5,958,893公开了利用现有载体如腺病毒载体或阳离子脂质体导入编码截短型CFTR的基因的方法。还证实，利用腺病毒介导向气道上皮的基因转移，其效率较低；腺病毒颗粒被表层浆膜摄入的速率较低可能是由于气道上皮细胞的最表层中基因转移的不足，以及同时缺乏αβγ3整联蛋白和CAR受体(它们是腺病毒的受体)(Goldman，M.等，Gene Ther.3811-818，1996，Boucher，R.C.，J.Clin.Invest103441-445，1999)。在阳离子脂质体的情况中，据报道粘液阻止了它们的摄入，通过除去粘液可提高基因转移效率(Kitson，C.等，Gene Ther.6534-546，1999，Zabner，J.等，J.Biol.Chem.27018997-19007，1995，Fasbender，A.等，Gene Ther.41173-1180，1997)。迄今为止，尚无能将外源基因有效导入气道上皮的载体系统和基因转移方法。因此，希望开发用于有效地向气道上皮转移基因的载体。仙台病毒属于副粘病毒科，是非常有效的基因转移载体，对它的开发一直没有间断(Kato，A.等，EMBO J.16578-598，1997，WO97/16538，WO97/16539)。仙台病毒毒性较低且能以非常高的水平表达导入在其中的基因。这种病毒也非常安全，因为插入该病毒载体的基因从来不会整合至宿主染色体中。据报道，仙台病毒载体的转染能力不同于腺病毒的(Goldman，M.等，Gene Ther.3811-818，1996，Boucher，R.C.，J.Clin.Invest 103441-445，1999)。例如，相对于未受损部位，腺病毒更倾向于感染受损部位(Kitson，C.等，Gene Ther.6534-546，1999，Zabner，J.等，J.Biol.Chem.27018997-19007，1995，Fasbender，A.等，Gene Ther.41173-1180，1997)。这些报道提示，仙台病毒可互补腺病毒的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的一个目标是提供一种能将外源基因导入气道上皮的载体以及一种利用所述载体导入外源基因的方法。本专利技术研究了各自含有外源基因的重组仙台病毒载体、腺病毒载体、和阳离子脂质体复合物体外和体内向来自各种动物的气道上皮细胞转移基因的效力。结果显示，仙台病毒载体比腺病毒载体和阳离子脂质体复合物更有效地将外源基因导入气道上皮细胞。本专利技术人还发现，重组仙台病毒载体不仅能将外源基因有效地导入容许性小鼠呼吸道，还能导入较大的动物如雪貂(ferret)、绵羊和人类的非容许性气道上皮细胞。而且，还发现仙台病毒载体可感染粘膜下腺体以及上皮细胞的最表面。根据这些发现完成本专利技术。具体地，本专利技术提供了将外源基因导入气道上皮的组合物，其中含有携带外源基因的重组仙台病毒载体。本专利技术还提供了将外源基因导入气道上皮的方法，该方法包括使含有重组仙台病毒载体的组合物与被粘液覆盖的气道上皮接触，其中所述仙台病毒携有外源基因。以下将详细说明本专利技术。本文中“重组仙台病毒载体”指由重组仙台病毒cDNA重建的病毒和病毒样颗粒产物，它包含重组仙台病毒RNA以及具有感染性的仙台病毒体。本文中术语“感染性”指病毒通过与细胞粘附而将其核酸等转移至细胞中的能力以及通过包括病毒包膜与宿主细胞膜融合在内的各种机制而穿透细胞的能力。所述重组仙台病毒载体可以是核糖核蛋白体(RNP)。本文中“基因”是指RNA和cDNA。“气道上皮细胞”是指出现在鼻、因、气管、或任何导气通道的内表面的假分层状纤毛上皮细胞以及杯状细胞和无纤毛细胞(Clara cell)，或出现在肺内换气泡包括I型和II型肺细胞(pneumocyte)的表面的细胞。本专利技术的重组仙台病毒载体携带重组仙台病毒基因。天然的仙台病毒载体由短的3’前导区、核衣壳(N)基因、磷(p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将外源基因导入气道上皮的组合物，其包含携有外源基因的重组仙台病毒载体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：米满吉和，长谷川护，埃里克W阿尔顿，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]