蚓激酶及其在血栓性疾病治疗中的应用制造技术

技术编号:1725435 阅读:175 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术提供了一种利用同源结构域克隆到的,能编码一种蚓激酶的全长cDNA序列、其所编码的氨基酸序列和可能的功能。其氨基酸序列全长为852bp,能编码283个氨基酸组成蛋白的开放阅读框架,理论推算此蛋白分子量为31KD,由原核或真核产生的重组蚓激酶具有体外溶栓活性,提示重组蚓激酶有可能应用临床治疗各种血栓性疾病。(*该技术在2021年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】
一、研究领域本研究涉及蚓激酶cDNA的克隆、核苷酸序列分析及生产其编码蛋白的方法和表达产物对纤维蛋白的溶解活性等方面;该基因的表达产物可能应用于人类血栓性疾病的预防和治疗。国内外研究现状二、血栓性疾病的发病率和死亡率均较高,并呈逐年升高趋势。目前临床上用于治疗血栓性疾病的药物,有的副作用较大,易引起出血,有的价格昂贵,且需静脉给药,使用不方便(秦智勇.溶栓疗法治疗急性血栓性脑梗死的实验研究.国外医学脑血管疾病分册,1998,6(1)31;CollenD.Thrombolytic therapy.Thrombosis and Haemostasis.1997,78(1)742.)。1983年Mihara等从蚯蚓粗提物中分离到一组具有纤溶酶活性的蛋白质,首次命名为蚓激酶(Mihara H,Sumi H,Akazawa T,et al.Fibriolytic enzymeextracted from the earthworm.Thromb Haemostas,1983,50258.)。大量研究表明蚓激酶无论静脉或口服给药,均具有溶栓作用(姜东胜,张国桢,王宝珍,等.赤子爱胜蚓纤溶酶的药理性质探讨.上海医科大学学报,1993,20(1)16.;扬树东,王平,李金荣,等.蚯蚓纤溶活性成分的抗凝及溶血栓作用.心肺血管杂志,1997,16(3)228.;短平,胡淑丽,曾耀辉.蚯蚓溶栓酶对大鼠凝血及纤溶指标的影响。时珍国药研究,1997,8(1)14)。蚓激酶作为蛋白质口服药物,先后在韩国和中国上市,在脑血管血栓性疾病治疗中显示出明显的疗效(庞式琪,丁铭臣,谢淑萍,等.抗血栓新药博洛克治疗缺血性脑血管病的临床观察.中华神经精神科杂志,1993,26(4)229.;黄德铭,陈百华,张国桢,等.蚯蚓酶治疗脑血栓形成的临床探讨.1992,12(4)3.)。目前应用的蚓激酶多是一组分子量20-60KD,pI3-5,具有激酶和溶酶活性的丝氨酸蛋白酶混合物,不易失活,具有较好的热稳定性和酸稳定性,多数为单体酶。药效学研究显示蚓激酶具有纤溶、抗凝、减轻缺血性脑损伤、改善血液流变性等多方面的作用,主要用于脑血管血栓性疾病的治疗(扬明,董桂华,张风琴,等。赤爱胜蚯蚓纤溶酶的研究IV.蚯蚓溶栓酶对家兔血栓溶解及大鼠实验性脑缺血的保护作用研究。生物技术,1995,5(3)9.;王彦生,富成志.双胸蚯蚓溶栓酶对沙土鼠脑缺血再灌注脑匀浆中ET,TXB2和6-keto-PGF1α的影响。沈阳医学院学报,1997,11(1)5.;张祖徇,钟良伟,郑国平,等.蚯蚓酶制剂对家兔血液流变学的影响.山西医学院学报,1992,23(1)1)。研究发现,蚓激酶在治疗中出凝血时间没有明显延长,未发现变态反应等不良副作用,是目前较为安全的溶栓药物,具有广泛的临床应用前景。有不少实验室曾尝试蚓激酶基因的克隆和表达研究,但无文献报道,先后有四条蚓激酶全长基因登陆到GeneBank上,基因表达及功能研究尚不清楚。我们根据其同源序列应用RT-PCR克隆到一条新的蚓激酶基因,并对其生物活性进行了初步探讨。三、本专利技术总结利用RT-PCR技术从蚯蚓肠道组织发现一种蚓激酶,碱基序列同已GeneBank登陆的序列有99%同源性,编码的氨基酸序列有三个不一致。构建原核及真核表达载体,证明其表达产物具有纤溶酶活性。蚓激酶可能用于人类血栓性疾病的预防和治疗。四、主要图表说明为了更好地理解本研究的内容,下面对主要图表加以说明附图说明图1显示蚓激酶全长编码区cDNA序列。图2蚓激酶完整的氨基酸序列。五、实施例1.材料赤子爱胜蚓,购自北京蚯蚓养殖厂;总RNA提取试剂、逆转录试剂及PCR试剂盒均购于Promega公司;原核表达载体pBV 220,本实验室保存,pET22b+由北京生物工程研究所赵志虎博士提供,真核表达载体pPIC9、pHIL-S1和pcDNA3.1(+)为本实验室保存,脂质体购自CLONTECH公司;JM103、JM109及BL21细菌菌株、GS115酵母株和COS-7细胞株为本实验室保存。2、赤子爱胜蚓总RNA的提取选一条大小适中的赤子爱胜蚓,在清水中浸泡过夜,使其翻尽肠中泥沙,称取约100mg组织,剪碎,迅速将其投入置有预冷TRIZOL的匀浆器中,充分匀浆,而后按TRIZOLTM试剂盒进行操作,RNA甲醛变性电泳证明RNA完整性良好,紫外分光光度计测定浓度,表明RNA纯度较高,-20℃保存。3、反转录及目的序列PCR以Oligo(dT)为起始引物,加入2μg总RNA,用Promega反转录试剂盒反转录,体系25μl。先将引物和模板混合70℃保温5分钟,然后迅速冷至0-4℃,加入其它反应成分,补DEPC水至25μl,37℃,60分钟,-20℃保存。根据GeneBank U25643端序列合成引物上游5’atg tta ctt ctcgcc ctt gc 3’;下游5’tca gtt gtt gtt ggt aat aat gtc t3’,以反转录产物为模板进行PCR10×REACTION缓冲液,5μl;25mM MgCl2,2μl;2.5mM dNTPs,1.6μl;20uM引物各0.2μl;模板2μl;Taq聚合酶,2μl;加水至20μl。反应条件为95预变性5分钟;95℃30秒,50℃30秒,72℃60秒;共30个循环,而后72℃延伸7分钟.用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。凝胶成像仪扫描成像,电泳结果表明,PCR得到一约850bp的单一产物,将PCR产物回收,并将其克隆到pUCm-T载体上,用氯化钙法制备的感受态E.coli JM109,转化后铺在含氨苄青霉素的LB平板上,进行蓝白班筛选,将具白班的克隆挑5个进行液体培养,提取质粒,酶切鉴定。电泳分析,取有与PCR产物一致的质粒,以通用引物T7,SP6双向测序(上海生工),得到一852bp的全长序列。结果发现本序列与U25643有高达99%的同源性,有完整的读框,该序列编码283个氨基酸。其中成熟肽含240氨基酸,其推演编码蛋白质分子量为26.6KD。4、原核表达载体构建及其表达根据扩增序列设计引物,上游为5’cg gaa ttc a atg att gtc gga gga att gaa g 3’,下游为5’cc aag ctt cta gtt gtt ggt aat aat gtc t 3’.以阳性克隆cDNA为模板进行PCR,产物经凝胶电泳分离后回收,将回收产物用EcoRI,HindIII双酶切,同时用该组酶切pBV220空载体,然后将目的片段定向克隆到pBV220上,取约10ng的连接产物,转化氯化钙法制备的感受态E.coli JM109,转化产物在含氨苄青霉素的LB平板上30℃培养过夜,挑转化子于10mL含氨苄青霉素的LB液体基中培养,提取质粒,用EcoRI,HindIII双酶切,将含有外源基因的重组子测序,结果显示插入方向正确,碱基序列无突变。将单个阳性克隆于5mL含氨苄青霉素的LB液体基中30℃培养过夜,次日取5%转接,30℃培养至OD600≅0.4~0.5]]>,迅速提高培养温度42℃,继续培养5小时,离心收集细菌,SDS-PAGE检测,表明有特异的蛋白表达带,本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蚓激酶,具有如下cDNA序列:ATGTTACTTCTCGCCCTTGCATCGTTGGTAGCGGTGGGTTTTGCGCAACCACCAGTCTGGTACCCCGGTGGTCAATGCGGTGTCAGCCAGTACTCAGAT GCTGGTGACATGGAACTTCCTCCCGGAACAAAAATTGTCGGAGGAATTGAAGCCAGACCATACGAGTTCCCATGGCAGGTGTCCGTCCGAAGGAAGTCTTCCGATTCCCATTTCTG CGGAGGTAGCATTATCAACGATCGTTGGGTTGTCTGCGCTGCTCACTGCATGCAGGGAGAGAGCCCTGCCCTGGTTTCCTTGGTCGTCGGTGAGCACGACAGCAGCGCTGCGAGTA CAGTACGTCAGACTCATGACGTTGACAGCATCTTCGTCCACGAGGACTACAACGGAAATACCTTTGAGAACGACGTTTCTGTCATCAAGACAGTTAACGCCATCGCTATCGACATC AACGTTGGGCCAATCTGCGCTCCAGATCCAGCCAACGATTACGTCTACCGTAAGAGCCAGTGCTCCGGATGGGGAACTGTCAACTCAGGTGGAGTCTGCTGCCCCAACGTTCTGCG ATATGTGACACTGAACGTCACAACCAACGCCTTCTGCGATGATATCTACAGCCCATTATATACAATTACCAGCGACATGATCTGCGCCACGGACAACACCGGACAGAACGAGAGAG ACTCTTGCCAGGGTGACTCTGGCGGCCCTCTGAGCGTCAAGGATGGCAGCGGAATCTTCAGCCTCATTGGTATTGTGTCTTGGGGAATCGGTTGCGCATCTGGATATCCAGGAGTC TACGCCCGCGTCGGATCCCAAACTGGATGGATCACAGACATTATTACCAACAACTGA。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:从玉文董国清王金惠苑晓玲善亚军陈家佩
申请(专利权)人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所
类型:发明
国别省市:11[中国|北京]

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