一种高效纯化基因工程菌重组表达产物的工艺及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种高效纯化基因工程重组表达产物的方法及其试剂。使用表面活性剂等助溶剂克服重组表达产物的聚合问题，提高纯化效率。使用层析系统和适当的分离纯化条件提高了基因工程重组表达产物的分离效率。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传工程领域，涉及一种高效纯化基因工程重组表达产物的工艺，主要是通过添加表面活性物质等助溶剂克服重组表达产物的聚合问题。干扰素是一种细胞因子，它是细胞对病毒感染应答中产生的一种具有抗病毒活性的蛋白质。按其来源不同，干扰素可以分为α干扰素(主要由B淋巴细胞产生)、β干扰素(由成纤维细胞产生)、γ干扰素(主要由T淋巴细胞产生)。人α干扰素还有各种亚型，至今已发现了20多种，α2干扰素是其中最主要的一种亚型。人α干扰素具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能，是临床上疗效确切，应用面广和市场需求量大的基因工程产品。人们最早采用细胞工程的方法生产人α干扰素，采用仙台病毒诱导一种淋巴细胞产生干扰素。用这种方法生产干扰素产量低、成本高，很难大量供应。基因工程技术的出现为大量制备廉价的人α干扰素创造了条件，最先建成的人α干扰素基因工程表达系统是大肠杆菌系统(Nagata，S.et al.Nature284，361-320，1980；Goeddel，D.V.et al.，Nature 287411-416，1980)，用大肠杆菌表达的人α2a干扰素和人α2b干扰素都已在1986年上市。但是，大肠杆菌表达的人α干扰素均为细胞内表达，表达产物在大肠杆菌细胞内以包含体形式存在，为了取得活性好的干扰素，需要经过复杂的变性和复性过程。另外，由于大肠杆菌会产生对人体有害的内毒素，在用大肠杆菌生产人α干扰素时，必须作很大的努力去清除内毒素。这些都给大规模生产带来困难。一些用大肠杆菌生产的干扰素常常会发生副作用，在大剂量使用时问题更为严重。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因工程表达系统与大肠杆菌系统相比虽然晚了近十年，但是，由于酵母菌是单细胞的真核生物，它在操作上与大肠杆菌一样简单，但它具有真核生物的基本特性。另外，几个世纪来，酵母一直被用来进行食品发酵，证明其不产生任何对人体有害的物质。1982年英国Tuite等首先用PGK1启动子在酿酒酵母中表达了人α2a干扰素(Tuite，M.F.et al.，EMBO Journal，1603-608，1982.)。他们采用的是胞内表达方式，分离纯化步骤极其复杂。1983年美国Hitzeman等用干扰素基因的信号序列来指导其在酵母菌中的分泌表达，他们发现信号肽加工不均一，所以表达的干扰素N端不均一(Hitzeman，Ronald A et al.，Science，219420-425，1983)。1984年美国Singh等改用酵母α因子基因的信号序列指导了人α干扰素的分泌表达，但是表达量仅达108IU/L(Singh，A.et al.，Nucleic Acids Research 12(23)8927-8938，1984)。1986年美国Zsebo等用酵母系统分泌表达了IFN-Con基因，结果表明仅有不足5％表达的干扰素在培养液中，95％以上的干扰素仍留在菌体内(Zsebo，K.M.et al.，J.Biological Chemistry，2815858-5895，1986.)。专利技术人等曾在1990年成功地构建了一个稳定性高的酵母载体pHC11，并利用PGK1启动子-α因子前导顺序和ADH1终止子建成了高效分泌表达人α2a干扰素的工程菌DC04/pHC11-IFN2a，表达量可达到1.02×1010IU/L(霍克克等，中国科学B辑，1992年，922-929，1992)。但是，将表达人α2a干扰素的酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a在丰富培养基YEPD中发酵，将发酵液通过截留分子量为10万的超滤膜过滤、浓缩、透析。然后将发酵液、滤出液和透析后的浓缩液进行凝胶电泳分析。分析结果表明滤出液只有很少量的干扰素，而在透析后的浓缩液中且含有大量的干扰素(附图说明图1)，说明极大部分的干扰素以分子量大于10万的聚合体存在。这种聚合体可能是由干扰素自身聚合而成，也可能是由干扰素与杂蛋白聚合而成。将上述发酵液进行各种柱层析技术分离，再对洗脱液各个组分进行凝胶电泳分析，可以发现在洗脱的各个峰中均有人α2a干扰素存在，人α2a干扰素的纯化得率非常低。因此，要提高得率首先要解决干扰素的解聚问题。本专利技术提出的纯化基因工程菌重组表达产物的方法，是在培养发酵阶段通过添加表面活性物质助溶剂，以解决重组表达产物的聚合问题。并相应建立了一条操作简单、收得率高的纯化重组表达产物的工艺路线。通过该方法，重组表达产物的纯化得率可达44％左右。本专利技术中所述的基因工程菌包括基因工程菌包括基因工程修饰过的细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等。本专利技术中所述的基因工程菌重组表达产物包括任何用途的蛋白质和多肽，包括但不限于蛋白质药物、疫苗、工业和农业用蛋白质等。本专利技术中，所述的助溶剂包括但不限于Tween(吐温)系列的表面活性剂。本专利技术中，所述的聚合包括重组表达产物自身聚合以及与其他物质的聚合。本专利技术中，所述的基因工程菌是酵母，表达产物是人α干扰素。上述酵母通常用酿酒酵母，其表达产物是分泌表达的人α干扰素。上述助溶剂通常用Tween-20，浓度范围为培养基的万分之五到千分之六。本专利技术对由酶母分泌表达的人α2a干扰素进行高效分离纯化。其方法步骤如下1、工程菌的发酵培养将表达人α2a干扰素的酿酒酵母工程菌DC04/pHC11-IFN2a接种在20ml补加腺嘌呤的基本培养液中，30℃左右下培养16-18小时后，作为种子液转接到的YEPD培养液(每升培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg和吐温-201ml)中，30℃下培养48小时。此时发酵液的细胞密度约为OD60020-24。在培养液中添加吐温后，吐温在培养液中的浓度一般为千分之六到万分之五，几乎所有分泌表达的人α2a干扰素都可以通过截留分子量为10万的超滤膜。2、人α2a干扰素的分离纯化a、离心除菌，收集上清液；b、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析I将离心收集所得的上清液用HAc调pH至3.4-5.4，然后上样至已用50mM pH4.4醋酸缓冲液平衡好的阳离子交换柱上(CM-SepharoseFF 2.6/10cm)，用同样缓冲液将未结合到介质上的蛋白质洗去，直至280nm吸收降到最低，用200mM醋酸缓冲液洗脱结合在介质上的部分杂蛋白，当吸收峰再次下降到最低时，再用400mM醋酸缓冲液进一步洗脱，收集到的各个分部用15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；c、CM-SepharoseFF阳离子交换柱层析II将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液上样到用100mM醋酸缓冲液平衡好的CM-SepharoseFF(1.6/4cm)柱上，用同样缓冲液洗去没有结合的蛋白质，直至280nm吸收降至最低时，再用300mM醋酸缓冲液进行洗脱，收集的各个分部通过15％浓度的SDS-PAGE分析确定含目标蛋白质人α2a干扰素的组分，然后将它们合并；d、Sephadex75凝胶过滤层析首先将Sephadex75凝胶柱(2.0/60cm)用含有150mMNaCl的磷酸缓冲液平衡，然后将前面所得的含有人α2a干扰素的收集液分批上样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使基因工程菌重组表达产物高效纯化的方法，其特征是在培养发酵阶段通过添加助溶剂，使重组表达产物解聚合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李育阳，高卜渝，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]