一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法技术

一种生产重组人ＩＬ－１２的方法，该方法包括：ａ）提供对应于具有第一信号肽的Ｐ３５亚基的核苷酸序列和对应于Ｐ４０亚基的核苷酸序列；ｂ）将步骤ａ）所述核苷酸序列插入表达载体中；ｃ）用步骤ｂ）获得的表达载体转化真核细胞；ｄ）在适合重组人ＩＬ－１２表达的条件下，培养步骤ｃ）所得的转染的真核细胞。该方法通过提高Ｐ３５亚基的表达强度使Ｐ３５和Ｐ４０两个亚基的表达量得到了平衡，从而提高了具有生物活性的ＩＬ－１２的表达量。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及一种提高重组人IL-12在真核细胞中表达强度的方法。
技术介绍
白细胞介素-12(IL-12)是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为35kDa(P35亚基)，另一条为40kDa(P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生。P35和P40单独存在时均无任何IL-12的生物活性。IL-12在细胞介导的免疫应答中是一种重要的调节因素，它作用于NK细胞和T淋巴细胞。(1)IL-12是NK细胞强有力的刺激因子，它可通过NK细胞诱导γ-干扰素的复制，并与白细胞介素-2有较强的协同作用。另外，除了刺激产生γ-干扰素外，IL-12还可增强NK细胞的溶细胞活性，而且还是NK细胞的生长因子。(2)IL-12刺激原初CD4+T细胞分化成TH1亚群，相应的IL-12和γ-干扰素的生产可控制TH1及TH2优势的T细胞的发展，这样有助于TH1分化优势，及对IL-4和IL-10的控制并提高TH2的分化。(3)IL-12刺激CD8+T细胞分化为成熟细胞，功能性激活的CTL，由于这些效应，IL-12在治疗一些播散性肿瘤方面有潜在的作用。IL-12能诱导NK细胞、T细胞等产生γ-干扰素，同时激活NK细胞和巨嗜细胞，增强其细胞杀伤活性，而且在γ-干扰素存在时显示阻碍肿瘤新生血管的作用。它在机体早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程中均扮演了极为重要的角色，它能显著杀死癌细胞。初步研究结果显示，重组人IL-12可以诱导全身性抗肿瘤免疫反应，从而抑制肿瘤生长或得到完全缓解。上述研究表明，IL-12是一种多功能的免疫调节因子，有可能成为治疗癌症的有效药物。另外，IL-12是目前发现的极少数增强DNA疫苗诱导细胞免疫的良好佐剂中最好的，预计将来在DNA疫苗的研究上将发挥独特的作用。综上所述，IL-12具有巨大的应用前景。然而，在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。因此，本领域中迫切需要有一种提高重组IL-12在真核细胞中的表达强度的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在真核细胞中高效表达IL-12的方法，从而克服现有技术中表达强度不高的缺点，从而大大降低生产成本。本专利技术提供了一种生产重组人白细胞介素-12的方法，该方法包括a)提供对应于P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列，其中所述P35亚基具有完整的第一信号肽；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中；c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL-12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞；e)从培养物中分离纯化得到白细胞介素-12。在上述方法中，真核表达载体可以是pMT2，真核细胞可选自CHO细胞、Vero细胞和COS细胞。在本专利技术的一个实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列是真核细胞所偏好的。在还有一个实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。本专利技术提供了一种能在真核细胞中高效表达重组人白介素-12的方法。与现有技术相比，本专利技术的方法可使P35亚基的表达提高大约8-17倍。由于P35亚基表达强度的提高，P35和P40两个亚基的表达量得到了平衡，从而使具有生物活性的IL-12的表达量得到显著提高。下面将进一步详细描述本专利技术。专利技术实施方式本专利技术提供了一种生产重组人白细胞介素-12的方法，该方法包括a)提供对应于P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列，其中所述P35亚基具有完整的第一信号肽；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中； c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL-12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞；e)从培养物中分离纯化得到白细胞介素-12。本文所用的术语“表达载体”通常指能在所选宿主细胞中复制的质粒或其它核酸分子。该表达载体可以自主复制，或可通过本领域熟知的方法插入宿主细胞的基因组中而进行复制。自主复制的载体具有在所选宿主细胞内起作用的复制起点或自主复制序列。通常，希望一个载体可用于多种宿主细胞内，例如在大肠杆菌中用于克隆和构建，在哺乳动物细胞用于表达。在本专利技术的一个实例中，所用的真核表达载体为pMT2(其图谱见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。然而，本专利技术也可采用本领域技术人员熟知的其它的合适载体。在本专利技术中，通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruse and Patterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。另外，宿主细胞系还可包括以下生物体，如细菌(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)、酵母、丝状真菌、植物细胞或昆虫细胞。本文所用的术语“转化”是指用熟知的方法将含有感兴趣的核酸的载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电穿孔；采用氯化钙、氯化铷磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。在本专利技术的一个实例中，转化方法是脂转染。如上所述，重组人白介素-12是一种70kDa的异二聚体，它由P35亚基和P40亚基组成。P35和P40基因的核苷酸序列分别显示在序列表SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中。P35亚基的氨基酸序列显示在序列表SEQ ID NO8中。研究表明，P35亚基只有与P40亚基形成二聚体后才能有效地分泌到细胞外。因此，本专利技术者将这两个基因分别插入到杆状病毒感染最晚期的多角体蛋白(polyhedrin)启动子和p10启动子后面，使这两个基因在量的方面尽可能有一均衡的比例。ELISA和Western印迹结果表明，杆状病毒可以使两个不同的基因在同一载体上得到有效的表达，并且能够正确地折叠、形成有生物活性的二聚体。Western印迹结果还表明，P40亚基单体的分泌量远远高于P35亚基。这一结果一方面支持P35亚基只有与P40亚基结合后才能分泌出细胞的观点，另一方面表明重组人IL-12在真核细胞中最终表达量的高低主要取决于P35亚基的表达量。由此可见，具有生物活性的IL-12的表达量主要取决于P35亚基的表达量。因此，欲提高IL-12的表达量，其一种可行的途径是提高P35亚基的表达量。在P35基因中，有两个起始密码子，其中第二个起始密码子位于第一个起始密码子后面的第35位。由于这两个起始密码子的存在，该基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产重组人白细胞介素－１２的方法，该方法包括： ａ）提供对应于Ｐ３５亚基的核苷酸序列和对应于Ｐ４０亚基的核苷酸序列，其中所述Ｐ３５亚基具有完整的第一信号肽； ｂ）将步骤ａ）所述核苷酸序列插入表达载体中； ｃ）用步骤ｂ）获得的表达载体转化真核细胞； ｄ）在适合重组人ＩＬ－１２表达的条件下，培养步骤ｃ）所得的转染的真核细胞； ｅ）从培养物中分离纯化得到白细胞介素－１２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万国光，李春澍，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]